^{Ana Ruiz de la Bastida, José Antonio Curiel*, Ángela Peirotén, Susana Langa, Juan Luis Arqués, José María Landete
Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA - CSIC). Carretera de La Coruña Km 7.5, 28040, Madrid, Spain
*joseantonio.curiel@inia.csic.es; Tlf: 913476886}

INTRODUCCIÓN

A lo largo de los años, el consumo de bebidas de soja se ha incrementado debido a sus bajos niveles de colesterol, su alto contenido en proteínas y fibra, así como a la presencia de importantes compuestos bioactivos, destacando las isoflavonas (1). Las isoflavonas se consideran fitoestrógenos debido a la similitud de su estructura con la de los estrógenos humanos y su afinidad con sus receptores (2).

Además, se han relacionado con la prevención de enfermedades como la diabetes, cáncer, enfermedades cardiovasculares y la reducción de los síntomas relacionados con la menopausia (3). Sin embargo, las isoflavonas, así como otros flavonoides de la soja saludables, suelen presentarse en su forma glicosilada insoluble, principalmente como daidzina y genistina, siendo necesaria su transformación en las agliconas daidzeína y genisteína, caracterizadas por su mayor biodisponibilidad, actividad estrogénica y antioxidante. Posteriormente, la daidzeína se puede metabolizar aún más a través de dihidrodaidzeína (DHD) a otros derivados como el equol y la O-desmetilangolensina (O-DMA). De manera similar, la genisteína se puede transformar en 5-hidroxi-equol o 6′′-hidroxi y-O- desmetilangolensina (6′′–OH–O-DMA) a través de la dihidrogenisteína (DHG) (4).

La acción enzimática de las enzimas β-glucosidasas presentes en los microorganismos intestinales permitiría la primera transformación de las isoflavonas en sus correspondientes agliconas. No obstante, existe una gran variabilidad entre individuos según la composición de su microbiota intestinal, lo que resulta en diferentes perfiles de metabolitos de flavonoides circulantes (5). Sin embargo, debido a que ciertas especies de lactobacilos y bifidobacterias son productores de enzimas involucradas en el metabolismo de isoflavonas, su aplicación como cultivos iniciadores para la fermentación de bebidas de soja permitiría aumentar la concentración de las isoflavonas agliconas (6), así como metabolitos secundarios O-DMA y 6′′–OH–O-DMA (7).

Teniendo en cuenta que las bebidas vegetales fermentadas se conservan generalmente mediante almacenamiento en frío durante su vida útil, en este estudio se ensayaron las cepas Limosilactobacillus mucosae INIA P508 y Bifidobacterium pseudocatenulatum INIA P815, ambas caracterizadas por producir buenos niveles de isoflavonas bioactivas y otros flavonoides (8), como cultivos iniciadores para la fermentación de bebidas de soja, estudiando su crecimiento, supervivencia y producción de flavonoides bioactivos tras la fermentación y tras 28 días de almacenamiento en frío. Además, se exploró el efecto del procesamiento térmico y su posterior almacenamiento sobre las principales isoflavonas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas y condiciones de cultivo

L. mucosae INIA P508 se cultivó a 37°C en caldo MRS durante 24 h en condiciones anaerobias (10% H2, 10% CO2 y 80% N2). B. pseudocatenulatum INIA P815 se cultivó en condiciones anaerobias a 37°C durante 48 h en caldo MRS suplementado con 0.5 g/L L-cisteína.

Fermentación de la bebida de soja y conservación en frío

La bebida de soja comercial Vital se adquirió para llevar a cabo los procesos de fermentación. Para ello, células de L. mucosae INIA P508 y B. pseudocatenulatum INIA P815 lavadas con PBS estéril se inocularon en la bebida de soja (6.5–7.0 log ufc/ml). La bebida inoculada se incubó durante 24 h a 37°C en condiciones anaeróbicas. Tras la fermentación, la bebida se alicuotó en tubos estériles, los cuales se conservaron a 5±1°C durante 28 días. La fermentación se llevó a cabo por duplicado en diferentes días. Como control se incluyó la bebida de soja no inoculada sometida a las mismas condiciones.

Se tomaron muestras para cuantificación de isoflavonas antes y después de la fermentación, y durante el almacenamiento en refrigeración a intervalos de 7 días (días 1, 7, 14 y 28). Además, se realizaron recuentos microbianos y determinaciones de pH antes y después de la fermentación, y durante el almacenamiento refrigerado a intervalos de 7 días.

Tratamiento térmico y conservación a temperatura ambiente

Las muestras de las bebidas de soja fermentadas y control también se alicuotaron por duplicado después de la fermentación en tubos de vidrio estériles y se sometieron a un tratamiento térmico de 80°C durante 15 min en un baño de agua. Posteriormente, los tubos se enfriaron y conservaron durante 28 días a 25°C. Las muestras para la cuantificación de las isoflavonas daidzina, genistina, daidzeína y genisteína se tomaron después del tratamiento térmico y después de 28 días de almacenamiento a 25°C.

La eficacia del tratamiento térmico en la inactivación del iniciador se comprobó a través de la inoculación de la bebida fermentada tratada térmicamente en placas de agar MRS o RCM. Además, se monitorizó la aparición de contaminantes mediante la incubación en PCA y VRBG Agar durante 48 h a 37 ◦C. El pH se analizó por duplicado.

Análisis de flavonoides

Los flavonoides de las diferentes muestras se extrajeron por duplicado. Daidzina, genistina, daidzeína y genisteína se analizaron por HPLC-PAD. Gliciteína, glicitina, 6′′-O-malonildaidzina, 6′′-O-malonilgenistina, 6′′-O-acetildaidzina, 6′′-O-acetilgenistina, DHD, DHG, O-DMA, 6′′–OH–O-DMA, tetrahidrodaidzeína (THD), tetrahidrogenisteína (THG), eriodictiol, naringenina, luteolina, kaempferol y quercetina se analizaron mediante HPLC-ESI/MS.

Análisis sensorial

Las características sensoriales de las bebidas se estimaron durante una prueba sensorial preliminar realizada por panelistas capacitados (n = 8). Se pidió a los participantes que evaluaran la calidad y la intensidad del olor de las bebidas, detectando posibles anomalías o defectos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando SPSS Statistics 22.0. Los datos fueron analizados por ANOVA utilizando un modelo lineal general. La comparación de medias se realizó mediante la prueba de Tukey para un intervalo de confianza del 99%.

RESULTADOS

Fermentación y almacenamiento en frío de bebidas de soja.

A pesar de que los recuentos de L. mucosae INIA P508 se mantuvieron estables tras la fermentación y durante el almacenamiento en frío de la bebida fermentada, los niveles de B. pseudocatenulatum INIA P815 aumentaron más de una unidad logarítmica durante la fermentación, aunque la viabilidad de la cepa disminuyó durante el almacenamiento en frío (Figura 1), alcanzando niveles no contables el día 28. En cuanto al pH de las bebidas fermentadas, ambas sufrieron una reducción de 7.1 a casi 5 debido al proceso de fermentación (Figura 1). Sin embargo, el pH se mantuvo estable durante los 28 días de almacenamiento en frío en ambas bebidas fermentadas (Figura 1).

Los principales glucósidos flavonoides daidzina y genistina, mostraron una disminución significativa (P < 0.01) en ambas bebidas de soja fermentadas con respecto al control (Tablas 1 y 2), siendo B. pseudocatenulatum INIA P815 la cepa que provocó la mayor disminución de estos compuestos. Entre las formas malonil y acetil de daidzina y genistina, solo se detectó 6′′-O- acetilgenistina y ambas cepas fueron capaces de metabolizarla significativamente (P < 0.01), volviéndose no detectable en el caso de L. mucosae INIA P508.

La metabolización observada de los glucósidos de isoflavonas estuvo acompañada por la formación de las correspondientes agliconas daidzeína y genisteína (Tablas 1 y 2). B. pseudocatenulatum INIA P815 mostró la mayor producción de agliconas. También se identificaron otros derivados de isoflavonas de la daidzeína y la genisteína como DHD y DHG y otros metabolitos como O-DMA, THD y 6′′–OH–O-DMA producidos por ambas cepas, mientras que equol, THG y 5-OH-equol no se detectaron. Adicionalmente, se observó el incremento significativo de los niveles de gliciteína, naringenina, eriodictiol, luteolina y kaempferol en las bebidas fermentadas, especialmente con L. mucosae INIA P508 (Tabla 3).

Durante el almacenamiento en frío, los principales glucósidos de isoflavonas daidzina y genistina, mostraron una tendencia decreciente en las bebidas fermentadas después de 28 días (Tablas 1 y 2). Esta disminución fue significativa en el caso de L. mucosae INIA P508. Consecuentemente, se apreció un aumento significativo (P < 0.01) de las principales agliconas daidzeína y genisteína tras los 28 días de almacenamiento en frío en ambas bebidas de soja fermentada (Tablas 1 y 2), así como incrementos en O-DMA, THD y 6′′–OH–O-DMA después de la refrigeración. Además, las agliconas minoritarias detectadas después de la fermentación estuvieron presentes también después del almacenamiento en frío y, en algunos casos, se observó un incremento significativo durante la conservación (Tabla 3), especialmente en el caso de B. pseudocatenulatum INIA P815.

Tratamiento térmico de bebidas de soja fermentada y almacenamiento a temperatura ambiente

Los análisis microbiológicos confirmaron la ausencia de bacterias viables, tanto de las cepas utilizadas como iniciadores como de bacterias contaminantes tras el tratamiento térmico de las bebidas fermentadas y mediante la posterior conservación a 25°C. Asimismo, el pH se mantuvo estable después del tratamiento térmico y durante su almacenamiento.

Los niveles de daidzina, genistina, daidzeína y genisteína en las bebidas no se vieron afectados significativamente por el tratamiento térmico, a excepción de la genistina en el control, la cual sufrió un ligero aumento tras el tratamiento (Tabla 4). A lo largo de los 28 días de almacenamiento a temperatura ambiente, se observó un incremento de las agliconas daidzeína y genisteína que sólo fue significativo (P < 0.01) en el caso de B. pseudocatenulatum INIA P815.

Análisis sensorial

La evaluación sensorial olfativa indicó que no había olores indeseables en las bebidas de soja fermentadas con cualquier cepa. Además, todos los panelistas describieron una mejora considerable del aroma en la bebida de soja fermentada por B. pseudocatenulatum INIA P815.

DISCUSIÓN

Teniendo en cuenta los beneficios de los flavonoides, principalmente las isoflavonas, existe un interés creciente en enriquecer los productos de soja con sus agliconas con el objetivo de mejorar su biodisponibilidad y su potencial efecto beneficioso sobre la salud. En este sentido, a pesar de las diferentes alternativas descritas para enriquecer el contenido de agliconas en productos de soja, y considerando que la fermentación permite una mejor transformación pleotrópica de las isoflavonas, este estudio describe el desarrollo de una bebida de soja fermentada enriquecida en agliconas y el análisis del comportamiento del producto durante la conservación en frío o después de un tratamiento térmico.

L. mucosae INIA P508 y B. pseudocatenulatum INIA P815 se seleccionaron por su capacidad para metabolizar gran espectro de flavonoides (7). A pesar que la bebida de soja constituye un sustrato adecuado para el crecimiento bacteriano, se observaron comportamientos diferentes entre las dos cepas seleccionadas. En este sentido, mientras que B. pseudocatenulatum INIA P815 creció durante la incubación, L. mucosae INIA P508 solo mantuvo sus niveles (Figura 1). No obstante, ambas cepas mostraron una disminución en el pH y fueron capaces de metabolizar flavonoides.

Las tasas de hidrólisis de los glucósidos variaron dependiendo de la cepa empleada como cultivo iniciador de la fermentación, siendo B. pseudocatenulatum INIA P815 la que alcanzó la mayor conversión de isoflavonas en menor tiempo. Esta bifidobacteria mostró una transformación casi completa de los glucósidos daidzina y genistina en sus respectivos agliconas daidzeína y genisteína al contrario que L. mucosae INIA P508. Sin embargo, L. mucosae INIA P508 produjo mayor concentración de gliciteína, O-DMA, 6″–OH–O-DMA, THD y los flavonoides luteolina, naringenina, eriodictiol y kaempferol. La mayor producción de naringenina, eriodictiol y kaempferol por L. mucosae INIA P508 probablemente estuvo influenciada por la presencia de una β-glucosidasa altamente eficiente y anotada en su genoma como GLU913 (8). Recientemente se observó que la expresión heteróloga de esta β-glucosidasa en ciertas cepas de bacterias lácticas y bifidobacterias mejoró el rendimiento de producción de una amplia gama de agliconas de lignanos, isoflavonas, flavonoles y flavanonas (8).

Un dato a destacar es el desequilibrio observado entre los glucósidos de isoflavonas transformadas y sus respectivas agliconas producidas por ambas cepas, lo que indica la presencia de otros precursores de las agliconas en forma de conjugados de acetilo y malonilo.

Aunque la presencia de 6′′-O-malonildaidzina, 6′′-O-malonilgenistina, 6′′-O-acetildaidzina y 6′′-O-acetilgenistina se ha detectado en otras bebidas de soja (9), en este estudio solo se detectó 6′′-O-acetilgenistina, precursor de genisteína. En cuanto a la conservación, se comprobó que el almacenamiento en frío durante 28 días no afectó negativamente a los niveles de isoflavonas agliconas y flavonoides bioactivos en las bebidas de soja.

Este hecho coincide con las observaciones de otros estudios, donde se describe que el metabolismo de los glucósidos de isoflavonas, que no se transformaron completamente durante la fermentación, continuó durante la conservación (10). En esta línea, en la bebida de soja fermentada con L. mucosae INIA P508, la transformación de daidzina y genistina a sus respectivas agliconas también se prolongó durante el almacenamiento en frío, alcanzándose las concentraciones máximas de ambas agliconas al final del almacenamiento (Tabla 1 y 2). A pesar de esto, B. pseudocatenulatum INIA P815 fue la cepa con mayor producción de daidzeína y genisteína.

Siguiendo con las alternativas de conservación, en este estudio también se aplicó un tratamiento térmico a las bebidas de sojas fermentadas, con el objetivo de desarrollar productos comerciales enriquecidos en isoflavonas bioactivas cuyas propiedades no fueran alteradas con el tiempo, pero sin necesidad de almacenamiento refrigerado. En este contexto, el tratamiento térmico aplicado no afectó a la concentración de isoflavonas. Esta observación coincide con estudios de estabilidad de las isoflavonas adicionadas a bebidas de leche sometidas a tratamientos térmicos de 72 a 138°C (11).

Otros estudios sobre la estabilidad de isoflavonas glucosiladas durante el tratamiento térmico han demostrado que estos compuestos son estables cuando se alcanzan temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua en ausencia de otros factores, e incluso un aumento en estos glucósidos podría ocurrir debido a la desesterificación de alonilglucósidos y acetilglucósidos por hidrólisis térmica (12).

Curiosamente, se observó un incremento general de los niveles de isoflavonas durante los 28 días de almacenamiento a temperatura ambiente (Tabla 4), a pesar de que no todas las diferencias fueron significativas (P < 0.01). Mientras que L. mucosae INIA P508 aumentó significativamente (P < 0.01) la genistina, B. pseudocatenulatum INIA P815 provocó el aumento tanto en las agliconas daidzeína como en genisteína.

El desarrollo de alimentos funcionales fermentados enriquecidos con agliconas de isoflavonas no solo facilitaría sus potenciales efectos beneficiosos para la salud, haciéndolos más accesibles, sino que también proporcionaría compuestos que sirvan como precursores para el metabolismo de la microbiota intestinal, produciendo compuestos secundarios de mayor biodisponibilidad, como equol. Además, la fermentación de la bebida de soja mejora el sabor y aroma del producto, por lo que en estudios posteriores se evaluarán parámetros sensoriales para completar la información del producto funcional a desarrollar.

CONCLUSIÓN

L. mucosae INIA P508 y B. pseudocatenulatum INIA P815 son cepas iniciadoras interesantes para la fermentación de bebidas de soja debido a su capacidad de conversión de isoflavonas en poco tiempo, alcanzando altos niveles de agliconas de isoflavonas en las bebidas de soja fermentadas funcionales. La refrigeración de los productos obtenidos, así como su tratamiento térmico y posterior almacenamiento a temperatura ambiente, parecen procedimientos de conservación adecuados que no afectaron la concentración de flavonoides bioactivos presentes en las bebidas de soja fermentadas. Estos resultados, por tanto, demostraron que las bebidas de soja fermentadas mantenidas en refrigeración mantienen o incluso aumentan los niveles de isoflavonas y que estos niveles de isoflavonas bioactivas alcanzados en estas bebidas dependen de la cepa bacteriana utilizada como cultivo iniciador. Por otro lado, y en la misma línea, el tratamiento térmico de las bebidas de soja fermentada eliminaría las bacterias y permitiría mantener las bebidas vegetales a temperatura ambiente manteniendo los niveles de isoflavonas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por el proyecto RTA2017- 00002-00-00 y RYC2019-026368-I del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidad de España. A.R.d.l.B, es beneficiaria de un contrato Predoctoral (PRE2018-086293) del Ministerio de Ciencia e Innovación de España.

Recientemente se ha publicado una versión ampliada de este trabajo en la revista LWT-Food Science and Technology (Ruiz de la bastida y cols., 2022, 154: 112872; DOI: 10.1016/j.lwt.2021.112872).