Gema Casado-Hidalgo, Gonzalo Martínez-García, Sonia Morante-Zarcero, Damián Pérez-Quintanilla, Isabel Sierra*
Departamento de Tecnología Química y Ambiental, E.S.C.E.T
Universidad Rey Juan Carlos, C/ Tulipán s/n, 28933 Móstoles, Madrid, Spain Contacto: isabel.sierra@urjc.es
RESUMEN
En los últimos años, se han producido casos de intoxicación y falsos positivos en test de drogas debido al consumo de semillas de Papaver somniferum L. (adormidera o amapola real) contaminadas con alcaloides opiáceos y alimentos elaborados con las mismas. Por este motivo, las autoridades sanitarias han mostrado un creciente interés, reclamando más estudios para conocer su concentración en los alimentos y poder establecer el consumo real de estos tóxicos por la población. Siguiendo esta línea de actuación, en este estudio se analizaron 14 muestras de semillas comestibles comerciales (11 semillas de adormidera y 3 mezclas de semillas) y 9 productos de panadería (5 palitos de pan y 4 pan de molde). En las semillas se encontraron cantidades considerablemente altas de todos los opiáceos, llegándose a superar en la mayoría de las muestras los límites máximos establecidos recientemente en el Reglamento (UE) 2021/2142 relativo al contenido máximo de alcaloides opiáceos en semillas de adormidera. Además, también se observaron casos de productos mal etiquetados que indicaban contener semillas de Papaver rhoeas L. (amapola común, la cual no tiene opiáceos) cuando en realidad se trataba de semillas de adormidera.
Con respecto a los productos de panadería analizados (5 palitos de pan y 4 panes de molde), las cantidades de opiáceos encontradas fueron inferiores, y más altas en el pan de molde que en los palitos de pan. Esto confirmó que el contenido de alcaloides opiáceos puede disminuir considerablemente con el procesado de los alimentos, si bien en 3 de las muestras analizadas se superó el contenido máximo establecido para los productos de panadería.
Palabras clave: Alcaloides opiáceos, semillas comestibles, adormidera, amapola, Papaver somniferum L., cromatografía de líquidos con detector de masas en tándem, extracción en fase sólida magnética.
INTRODUCCIÓN
Las semillas de la planta Papaver somniferum L., comúnmente conocida como adormidera o amapola real, están siendo cada vez más utilizadas en muchos países como ingrediente alimentario. Se usan principalmente para la elaboración de productos
de panadería, bollos, snacks, como toppings para ensaladas, yogures, cremas o incluso para hacer infusiones o la obtención de aceite. Estas semillas no contienen opiáceos en sí mismas, pero pueden contaminarse con el látex de la propia planta a causa de malas prácticas de cosechado o por el daño producido en la cápsula por los insectos [1]. Los principales opiáceos que pueden estar presentes son morfina, codeína, tebaína, papaverina, noscapina y oripavina. El consumo de semillas contaminadas puede provocar efectos adversos en la salud, especialmente en personas vulnerables y puede derivar en cantidades considerables de opiáceos en muestras biológicas como sangre, orina y saliva, provocando incluso falsos positivos en test de drogas [2], [3]. Por todo ello, muchos países han estado tomando algunas medidas como establecer una clasificación de las variedades de plantas con bajo nivel de opiáceos para su uso alimentario, establecer límites máximos para estos alcaloides o, incluso, prohibir su utilización en los alimentos [2], [4]. La falta de una legislación armonizada ha dado lugar a que las autoridades sanitarias demandaran un mayor estudio de esta familia de tóxicos, con el fin de establecer una adecuada legislación [5].
Finalmente, el 3 de diciembre de 2021, la Comisión Europea ha establecido el contenido máximo de alcaloides opiáceos en determinados productos alimenticios, como las semillas de adormidera enteras o molidas comercializadas para el consumidor final
y los productos de panadería [6]. Además, cabe destacar que la mayoría de los estudios publicados hasta la fecha, e incluso el propio reglamento de la Unión Europea, solo se han centrado en el análisis de morfina y codeína, sin prestar atención a los demás opiáceos que, como remarca la EFSA en su dictamen de 2018, pueden aparecen en concentraciones altas y preocupantes debido a su elevada toxicidad [1], [5]. Otro problema observado a nivel comercial es el etiquetado incorrecto de algunos productos, puesto
que en la etiqueta se indica semillas de Papaver rhoeas L. en vez de semillas de adormidera. Este es un aspecto importante porque la planta de la amapola común (Papaver rhoeas L.) no contiene opiáceos, a diferencia de la adormidera que sí los contiene.
Usos de la adormidera: propiedades farmacéuticas y nutricionales
La adormidera se conoce desde la antigüedad, como planta medicinal y culinaria, por sus propiedades farmacéuticas provenientes del látex y nutricionales por sus semillas (Figura 1). Su látex (opio) obtenido de las cápsulas de la planta puede contener hasta 80 alcaloides diferentes, pero los principales son morfina, codeína, tebaína, papaverina, noscapina y oripavina. Gracias a la presencia de estos alcaloides del opio, esta planta ha sido tradicionalmente muy utilizada con fines medicinales, por sus propiedades farmacológicas [5]. Así, la morfina y codeína tienen propiedades analgésicas, la papaverina es un vasodilatador coronario y la noscapina es un supresor de la tos. Otros alcaloides como la tebaína y oripavina no son útiles debido a su alta toxicidad, pero se utilizan para producción de opiáceos sintéticos.
Por otro lado, las semillas de adormidera se utilizan en la elaboración de alimentos debido a su buena calidad nutricional, ya que son ricas en ácidos grasos, mayoritariamente ácido linoleico, oleico y palmítico [7], [8]. Además, las semillas, a diferencia del látex, no contienen alcaloides y por esta razón, se han utilizado ampliamente en países de la Europa Central para la elaboración de productos de panadería, bollería, en rellenos de tartas, pasteles y postres, e incluso para producir aceite comestible [1]. Otro uso generalizado de estas semillas de adormidera es la preparación de infusiones [9], [10]. Las semillas también pueden venderse solas o mezcladas con otras semillas, como la chía, lino o mijo, y se agregan principalmente a ensaladas, cremas, yogures y en platos de pasta [1].
Sin embargo, en los últimos años algunos estudios han demostrado la presencia de grandes cantidades de alcaloides del opio en las semillas de adormidera. Esto puede deberse a la contaminación con los alcaloides presentes en el látex, causada por unas malas prácticas de recolección o por daños producidos en la cápsula por los insectos. Por esta razón, el consumo de semillas de adormidera contaminadas puede ser un riesgo para la salud [5]. Este aspecto puede explicar los casos de intoxicación, falsos positivos en los test de drogas y las dependencias que han aparecido en los últimos años por el consumo de estas semillas. Así, en algunos estudios científicos se han analizado muestras de sangre, orina o saliva, después del consumo de semillas de adormidera o alimentos a base de estas semillas.
Los resultados han demostrado que el consumo de estos productos puede dar lugar a cantidades considerables de opiáceos en las muestras biológicas [3], [11], [12].
Legislación y recomendaciones para prevenir y reducir los alcaloides del opio en semillas de adormidera
Hasta la fecha, no había una legislación europea sobre opiáceos en semillas de adormidera y productos de panadería, por lo que cada país ha estado llevando a cabo diferentes acciones [1]. En Bélgica solo se podían utilizar semillas de adormidera en productos de panadería [4]. En Austria, se estableció una clasificación de variedades con bajo contenido de morfina para uso alimentario [13]. En Alemania, se estableció un límite máximo de 4 mg/kg de morfina y, en Hungría de 30 mg/kg de morfina, 20 mg/ kg de noscapina, 40 mg/kg de la suma de morfina y noscapina, 20 mg/kg de tebaína y 20 mg/kg de codeína [4]. Además, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) en 2011 llevó a cabo una evaluación de riesgos y estableció una dosis de referencia aguda de morfina de 10 µg por kg de peso corporal [2]. Además, en los últimos años, se han publicado numerosas alertas sanitarias en el RASFF (Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos), concretamente se registraron 32 notificaciones desde la primera en 2005, 26 se consideraron alerta y 6
solo información, encontrándose concentraciones de morfina muy variables, entre 14 y 369 mg/kg.
Solo un 22% de las alertas se dieron a causa de controles propios de la empresa productora, el resto se detectaron por controles oficiales con el producto ya en el mercado [14]. Por esta razón, en 2016 se estableció en la UE un nivel de referencia de carácter no vinculante de 10 mg/kg de morfina en semillas de adormidera para consumo humano directo hasta que se establecieran nuevas medidas [15].
Finalmente, el 3 de diciembre de 2021, la Comisión Europea ha establecido el contenido máximo de alcaloides opiáceos (expresado en equivalentes de morfina = morfina + 0,2 x codeína) en determinados productos alimenticios, concretamente 20 mg/kg para las semillas de adormidera enteras o molidas comercializadas para el consumidor final y 1,5 mg/kg para productos de panadería [6].
Respecto a las recomendaciones para prevenir y reducir los alcaloides del opio en semillas de adormidera, en 2014 la UE publicó una serie de recomendaciones sobre buenas prácticas agrícolas y de procesado de semillas para reducir el contenido de morfina [13]. Respecto a las prácticas agrícolas durante el cultivo, cosecha y almacenamiento se destacaba elegir variedades con menor contenido de alcaloides del opio para uso alimentario, controlar posibles enfermedades y plagas fúngicas y controlar el porcentaje de humedad. Por otro lado, también se recomendaron algunas prácticas de procesamiento para reducir la presencia de alcaloides del opio en las semillas y alimentos elaborados con las mismas, donde se destacaba que diversos tratamientos pueden disminuir considerablemente el contenido de morfina. Tal y como se muestra en la Tabla 1, se ha demostrado en numerosos estudios científicos que el procesado disminuye considerablemente el nivel de morfina. Así, el lavado, puede disminuir la morfina desde un 40% en agua fría [10], [16], [17] hasta un 100% si es con agua caliente [17]. Por otro lado, la molienda de las semillas puede reducir entre un 25 y 35% el contenido en morfina [17], [18]. En el caso del horneado, la reducción dependerá en mayor medida de las condiciones de tiempo y temperatura utilizadas, llegando a obtenerse hasta un 50% de reducción de morfina a 200°C durante 30-40 min [16]. Además, si este proceso de horneado se complementa con uno de lavado o molienda previo, se pueden llegar a obtener reducciones de entre el 80-100% de morfina [19].
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de muestras
A finales de 2020 se compraron en España 14 muestras de semillas comestibles en supermercados y herbolarios, tres de ellas mezclas de diferentes semillas. Con fines comparativos, se recolectaron dos muestras silvestres en el campo, una de adormidera y otra de amapola común. Además, a mediados de 2021 se adquirieron en distintos supermercados 9 muestras de productos de panadería que contenían semillas de adormidera (entre un 1 y 6%), 5 de ellas palitos de pan y 4 muestras de pan de molde. Algunos ejemplos de las muestras analizadas aparecen en la Figura 2.
Cuantificación por UHPLC-TQ-MS/MS
La determinación de los alcaloides del opio se realizó con un sistema de UHPLC (Advance Elute, Bruker, Billerica, MA, USA) acoplado a un detector de espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo (EVOQTM Elite, Bruker) con una fuente de iones de electrospray (ESI). La separación cromatográfica se realizó en una columna Intensity Solo 2 C18 (100 mm x 2,1 mm, Bruker, Billerica, MA, EE.UU.) a 30 °C. El volumen de inyección fue de 10 µL (inyección parcial) y el caudal se mantuvo constante en la fase móvil a 0,4 mL/min durante el análisis. Se utilizó una elución en gradiente combinando la fase móvil A de agua con la fase móvil B de acetonitrilo, ambas conteniendo 0,1% de ácido fórmico. El gradiente lineal comenzó en 95% A, en el minuto 3,5 cambió al 30%
de A, en el minuto 3,7 volvió al 95% de B y luego se mantuvo en isocrático hasta el minuto 5.
La detección de cada analito se determinó por infusión directa de una solución estándar en metanol de 1 µL/ mL de cada alcaloide del opio utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 20,0 L/min. El espectrómetro de masas funcionó en modo de fuente de iones de electrospray positivo (ESI+) con monitorización de reacciones múltiples (MRM) aislando el ion precursor [M+H]+ y dos o tres iones producto para cada analito. Para ello, se utilizó N2 como gas de secado (350 °C y 40 psi); una temperatura de cono y una presión de gas de 300 °C y 20 psi, respectivamente; Ar como nebulizador (60 psi); y gas de colisión (2 mTorr) y tensión de pulverización de iones de 4200 V; recogida con retardo de 0,6 minutos y una tensión de detector de 1,65 V. Los parámetros óptimos para la detección por MRM para el análisis de cada uno de los alcaloides del opio se muestran en la Tabla 2.
Métodos de extracción de los alcaloides
a) Extracción de alcaloides en muestras de semillas
En primer lugar, se realizó una doble extracción de los compuestos en 2,5 g de semillas con 30 mL de metanol/agua, 50/50 (v/v). La mezcla se agitó con vórtex durante 30 s y después 30 min con agitación magnética. Posteriormente, se llevó a cabo una etapa de purificación mediante extracción en fase sólida magnética (MSPE), siguiendo los pasos mostrados en la Figura 3. Para la purificación, se sintetizaron previamente partículas magnéticas recubiertas por una doble capa de sílice amorfa y mesoestructurada.
Se tomaron 2 mL del extracto, se agregaron 50 mg de partículas magnéticas y se agitó durante 1 min en ultrasonidos (US). Luego, con la ayuda de un imán, se decantó la disolución y se realizó una doble desorción de los analitos con 2 mL de éter dietílico/ metanol 80/20 (v/v) y 1 min de US. Finalmente, 2 mL de extracto purificado se evaporaron a vacío, se reconstituyeron en 1 mL de agua/acetonitrilo 90/10 (v/v) con un 0.1% de ácido fórmico y se filtró para su análisis cromatográfico.
b) Extracción de los alcaloides en productos de panadería
Se hizo una doble extracción de los compuestos en 2,5 g de muestra con 10 mL de metanol acidificado con 0,1% de ácido fórmico. La mezcla se agitó con vórtex durante 30 s y 30 min magnéticamente y se centrifugó durante 10 min a 6000 rpm. Se tomaron 2 mL del extracto para su posterior purificación por MSPE (Figura 3), utilizando en este caso 1 mg de partículas magnéticas recubiertas con un material metal- orgánico poroso cristalino (MOF). Tras 1 min en el US, se decantó la disolución con la ayuda de un imán y se desorbieron los analitos con 2 mL de agua/acetonitrilo 90/10 (v/v) con 0,1% ácido fórmico (1 min en el US). Finalmente, se tomó 1 mL del sobrenadante y se filtró para su análisis cromatográfico.
Validación de los métodos de análisis desarrollados Los métodos desarrollados para la determinación de los seis alcaloides del opio en semillas de adormidera y productos de panadería (palitos de pan y pan de molde) fueron validados en términos de linealidad, límites de detección y cuantificación del método (MDL y MQL), efectos de matriz (ME), exactitud y precisión. Dado que no existe un reglamento oficial para las metodologías de validación de opiáceos cuantificados en semillas de adormidera, la validación se realizó de
acuerdo con los criterios establecidos en el documento SANTE/11813/2017 para el control de calidad analítica de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos [20].
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Validación de los métodos de análisis desarrollados
Los métodos desarrollados para la determinación de los seis alcaloides del opio en semillas de adormidera y productos de panadería (palitos de pan y pan de molde) fueron validados con éxito [20] tal y como se muestra en la Tabla 3. Se obtuvieron amplios rangos lineales con un adecuado coeficiente de correlación lineal (R2 > 0,999). El efecto matriz generalmente estuvo comprendido entre 80-120%, lo que indicó que la etapa propuesta de purificación eliminó la gran parte del efecto matriz y por ello se podría haber cuantificado con la recta de calibrado de disolvente. Sin embargo, algunos casos como morfina, noscapina y oripavina en las semillas de adormidera tuvieron un efecto de supresión de la señal y por ello la cuantificación se realizó con las rectas de calibrado de matriz. Además, los límites de detección y cuantificación del método (LDM y LCM) fueron considerablemente bajos, en el orden de los ppb (µg/kg). Además, la exactitud y la precisión fueron correctamente obtenidas, con unos valores de recuperación y de RSD aceptables, entre 80-120% y ≤20%, respectivamente. Cabe destacar que el valor de recuperación obtenido en morfina y oripavina en semillas de adormidera fueron algo inferiores (en torno al 50%). Sin embargo, como la precisión obtenida en estos casos fue favorable (≤20%), también se pudieron cuantificar estos analitos en las semillas de adormidera aplicando el valor de recuperación obtenido como factor de corrección [20]. Por ello, todos estos resultados indicaron que los métodos propuestos mostraron un buen desempeño analítico y podían ser utilizados para la cuantificación de semillas de adormidera y de productos de panadería.
Contaminación de semillas comerciales con opiáceos
Respecto a las semillas, se analizaron un total de 16 muestras, de las cuales 11 fueron semillas de adormidera comerciales, 2 semillas silvestres recolectadas (una de amapola común y otra de adormidera) y 3 mezclas comerciales de semillas. Tal y como se muestra en la Tabla 4, en todas las muestras comerciales analizadas se identificaron los seis alcaloides opiáceos, por lo que se puede concluir que todas las muestras estaban contaminadas con látex.
Esto resultó sorprendente porque tres de las muestras de semillas comerciales indicaban en su etiqueta que se trataba de semillas de Papaver rhoeas L., la cual no contiene opiáceos en su látex (muestras S3, S5 y S6). Para confirmar este hecho, se recolectaron y
analizaron semillas de amapola silvestre (S10), en las que no se detectó ninguno de los opiáceos, y semillas de adormidera silvestre (S9), en las que se encontraron los seis opiáceos. Esto confirmó que el etiquetado de las semillas comerciales S3, S5 y S6 analizadas era incorrecto.
En lo que respecta a los niveles de opiáceos encontrados en las semillas comerciales analizadas, en el caso de la morfina, se determinó un rango de concentraciones de entre 1,5 y 249 mg/kg, lo que estaba de acuerdo con los valores observados previamente por otros autores [9], [16], [21], [22] [23]. En cuanto a la codeína, se determinaron concentraciones que varían desde niveles inferiores al límite de cuantificación del método (0,2 mg/kg) hasta 46 mg/kg, en consonancia con los datos ofrecidos en estudios previos [21]. Para otros opiáceos se encontraron valores de hasta 136 mg/kg para la tebaína, 27 mg/kg para la papaverina y 109 mg/kg para la noscapina. Además, es de destacar que hasta la fecha en ningún estudio previo se había analizado la oripavina en semillas de adormidera, encontrándose en este trabajo valores de hasta 33 mg/kg.
Los resultados encontrados en las semillas analizadas confirmaron la falta de control que hay actualmente y la falta de cumplimiento con los niveles que se han establecido e, incluso, con el reglamento recientemente publicado que entrará vigor a partir del 1 de julio de 2022. El 87% de las cantidades encontradas (Tabla 4) superaron el límite máximo que estaba establecido en Alemania y el 73% superó tanto el nivel de referencia establecido en la UE, como el límite húngaro de morfina. Para el resto de los alcaloides opiáceos, solo hay establecido actualmente un límite máximo en Hungría de 20 mg/kg, por lo que dos muestras superaron el límite máximo de codeína, dos el de tebaína, tres el de papaverina y siete el de noscapina. Respecto al límite máximo recientemente establecido por la UE, de las 11 muestras de semillas de adormidera comerciales analizadas, 9 superaron los 20 mg/kg de equivalentes en morfina (morfina + 0,2 x codeína), llegando a ser muy superiores en la muestra S2 y S3 (Tabla 4) [6].
Finalmente, en las tres mezclas de semillas (compuestas por semillas de girasol, sésamo, lino marrón, pipas de calabaza y amapola), en las que el contenido de semillas de amapola era solo de aproximadamente 5-10%, se encontraron bajas concentraciones de opiáceos en todas las muestras (Tabla 4). Sin embargo, en una de ellas (MIX2) la cantidad de morfina (54 mg/kg) fue considerablemente alta, llegando a ser el contenido de morfina y codeína, expresado en equivalentes de morfina, más del doble de lo permitido [6].
Contaminación de productos de panadería con opiáceos
Se analizaron 9 muestras de productos de panadería, de las cuales 5 muestras fueron de palitos de pan y 4 de pan de molde. Tal y como se muestra en la Tabla 4, las cantidades encontradas en estos productos fueron inferiores a las que se cuantificaron previamente en las semillas de adormidera, en especial en las muestras de palitos de pan en las que solo se pudo cuantificar tebaína en una de ellas (con una concentración máxima de 0,2 mg/kg). Respecto a los opiáceos identificados en estos productos, se detectó codeína en una de las muestras (G4), tebaína en tres muestras (G3, G4 y G5), papaverina en todas excepto una (G5) y noscapina en una de ellas (G3). La morfina y la oripavina no fueron detectadas en las muestras de palitos de pan. Estos resultados confirmaron que el procesado influye de manera significativa en la reducción de los niveles de alcaloides opiáceos, lo que está de acuerdo con estudios previos de otros autores [21] [23]. Sin embargo, se observó una mayor disminución en las muestras de palitos de pan que en las de pan de molde. La morfina fue identificada en dos de las cuatro muestras analizadas, observándose hasta 0,2 mg/kg en la muestra P4. Respecto a la papaverina, todas las muestras estuvieron por debajo del límite de cuantificación del método, excepto en una de ellas en la que este compuesto no fue detectado. La noscapina fue identificada solamente en dos muestras (P1 y P3), donde la concentración más alta encontrada fue de 0,2 mg/kg. La oripavina no fue detectada en el pan de molde, mientras que si se encontraron valores altos de codeína y tebaína. Estos dos opiáceos fueron identificados en todas las muestras, llegando a observarse concentraciones de hasta 15,9 y 2,5 mg/kg, respectivamente (ambas en la muestra P2).
Esto pone de manifiesto que las semillas utilizadas en la elaboración de estos productos estaban muy contaminadas, ya que, si consideramos que el producto fue elaborado con un 5% de semillas, las semillas en origen deberían tener aproximadamente 300 mg/kg de codeína, esto sin tener en cuenta las posibles pérdidas por efecto del procesado que puede reducir en un 25-100 % el contenido de alcaloides de las semillas [6]. Debido a estos resultados, de cuatro muestras de pan de molde analizadas, tres de ellas (PM 2, 3 y 4) superaron el límite máximo establecido por la UE (1,5 mg/kg de equivalentes en morfina) (Tabla 4).
CONCLUSIONES
Tras analizar distintas muestras comerciales de semillas de adormidera se observaron rangos de concentración elevados de todos los alcaloides opiáceos estudiados, nueve de las once muestras de semillas de adormidera analizadas superaron el límite máximo de alcaloides opiáceos recientemente establecido por la UE y el 85% superaron el nivel de referencia establecido por la UE en el 2016 de 10 mg/kg. Por otro lado, se analizaron 9 muestras de productos de panadería con semillas de adormidera, observándose concentraciones muy bajas en las muestras de palitos, estando por debajo del límite de cuantificación del método. Sin embargo, tres de las cuatro muestras de pan de molde superaron el límite máximo establecido para productos de panadería por la UE. Esto demuestra que el procesado influye en la reducción de los alcaloides opiáceos, pero que no afecta por igual a todos los productos de panadería.
Por todo ello, el contenido de alcaloides opiáceos en semillas de adormidera destinadas al consumo humano directo debería reducirse al nivel más bajo posible, como por ejemplo mediante lavados con agua. En el caso de los productos que son sometidos a altas temperaturas, como son los productos de panadería, se debería establecer un tratamiento que asegure al máximo su reducción. En cualquier caso, a este respecto todavía queda bastante por estudiar, en especial cómo afecta el procesado, además de a la morfina y a la codeína, al resto de alcaloides opiáceos que también están presentes en altas concentraciones y son potencialmente tóxicos.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación ha sido financiada por MCIU/AEI/ FEDER, UE para el proyecto RTI2018-094558-B-I00.
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