Berta Torres Cobos1,2, Cèlia Asensio Manzano1, Beatriz Quintanilla Casas1, Soriana B. Nicotra1,2, Francesc Guardiola1,2, Agustí Romero3, Mercè Rovira3, Anna Teixidó4, Neus Aletà5, Maurizio Servili6, Alba Tres1,2, Stefania Vichi1,2
1. INTRODUCCIÓN
El origen geográfico de un alimento influye de forma decisiva en la percepción de su calidad por parte del consumidor, así como en el valor que alcanza en el mercado. En ciertos productos, el prestigio vinculado a su procedencia es particularmente relevante, lo que los hace especialmente vulnerables al fraude alimentario relacionado con la falsificación de su país o región de origen. El fraude alimentario perjudica a toda la cadena de valor, ya que compromete la imagen del producto, reduce la confianza del consumidor y debilita su competitividad del sector. Además, puede suponer un riesgo para la seguridad alimentaria al no poder garantizarse la trazabilidad del producto.
Ejemplos emblemáticos de productos con alto valor comercial, cuya reputación territorial incrementa significativamente su valor económico y los hace vulnerables a la falsificación con alternativas más económicas, son el aceite de oliva virgen y los piñones. El país de origen tiene un impacto significativo en el aceite de oliva producido en ciertos países mediterráneos de la UE, como Italia (Kavallari et al., 2014). Esto se refleja en el mercado, donde estos aceites pueden alcanzar precios hasta un 45 % superiores a los de aceites procedentes de fuera de la UE (Bimbo, 2020). De la misma manera, los piñones mediterráneos alcanzan precios superiores a 100 EUR/kg (Mutke, 2022), mientras que los piñones asiáticos, mayoritariamente procedentes de China y Rusia, suelen venderse a precios a menudo por debajo de un tercio de este valor (Evaristo et al., 2013; Moscetti et al., 2021; Mutke, 2022). A diferencia de otros productos agroalimentarios, que cuentan con variedades distribuidas mundialmente, las especies botánicas de piñón están estrictamente vinculadas a su origen geográfico. En la región mediterránea predomina Pinus pinea L. (P. pinea), junto con Pinus Halepensis y Pinus Brutia en el Mediterráneo occidental y en Turquía, respectivamente, mientras que en China y Rusia son más comunes Pinus koraiensis (P. koraiensis) y Pinus sibirica (P. sibirica), respectivamente.
Considerando la influencia que el origen tiene en las decisiones de compra de los consumidores, la normativa europea establece la obligación de declarar la proveniencia en el etiquetado de estos productos alimentarios. Sin embargo, la ausencia de métodos oficiales para verificar esta información, más allá de la revisión documental, genera una brecha crítica en la trazabilidad y la integridad de la cadena alimentaria. Frente a esta problemática, se ha observado un creciente interés por parte de la comunidad científica y los laboratorios de control en el desarrollo de herramientas analíticas rápidas, fiables y económicamente viables para la autenticación. En este contexto, los enfoques basados en metabolómica no dirigida emergen como alternativas muy prometedoras. El enfoque denominado fingerprinting, o huella digital, ha ganado protagonismo como estrategia eficaz para la clasificación y autenticación de alimentos. Esta aproximación se basa en el tratamiento estadístico de los datos brutos obtenidos por técnicas instrumentales, cromatográficas o espectroscópicas, permitiendo detectar patrones característicos sin necesidad de identificar individualmente los compuestos presentes (Cuadros-Rodríguez et al., 2016). A diferencia de los enfoques dirigidos o de perfilado, que se centran en determinar uno o varios compuestos seleccionados, el enfoque de fingerprinting utiliza la totalidad del perfil químico del alimento, lo que lo hace especialmente eficaz para detectar diferencias sutiles entre productos auténticos y fraudulentos. La incorporación de herramientas quimiométricas, como el análisis discriminante por mínimos cuadrados (Partial Least Square-Discriminant Analysis, PLS-DA), ha facilitado la aplicación de esta metodología en distintas matrices alimentarias, con resultados prometedores en productos como aceites, especias y vinos (Quintanilla- Casas et al., 2025).
Además del enfoque analítico, otro aspecto clave en el desarrollo de un método de autenticación es la selección de marcadores adecuados. El estándar de referencia para los marcadores en autenticación alimentaria es que estén directamente relacionados con la característica que se desea autenticar. En el caso de la autenticación geográfica, los marcadores deben estar vinculados a las particularidades de la zona de origen, como los factores pedoclimáticos, geográficos e incluso las especies o variedades típicamente cultivadas en cada región. En este sentido, los terpenos volátiles y semivolátiles —principalmente mono- y sesquiterpenos— se han demostrado válidos marcadores de origen varietal y geográfico en productos vegetales (Avula et al., 2014; Marti et al., 2014; Torres-Cobos et al., 2021; Matsushita et al, 2018; Quintanilla-Casas et al., 2022). Se trata de metabolitos secundarios cuya presencia y proporción están fuertemente influenciadas por factores genéticos y ambientales propios de la región de cultivo, pero presentan una gran estabilidad frente a condiciones de procesado y almacenamiento. Su análisis mediante microextracción en fase sólida en espacio de cabeza acoplada a cromatografía de gases y espectrometría de masas (Head Space-Solid Phase Microextraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry, HS-SPME-GC- MS) constituye una técnica analítica consolidada, automatizable, no destructiva y económicamente viable para muchos laboratorios de control. Además, no requiere disolventes ni reactivos, y permite el análisis automatizado con una mínima preparación de muestra. Esta sencillez operativa facilita su integración en análisis de rutina, tanto para la industria como para autoridades competentes.
El uso de los terpenos volátiles y semivolátiles como marcadores químicos, combinado con estrategias de fingerprinting y herramientas quimiométricas, puede ser una solución innovadora y asequible para afrontar los desafíos actuales en la autenticación de alimentos. El objetivo de este trabajo es evaluar la eficacia, rapidez y viabilidad económica de esta metodología para la autenticación geográfica y varietal de productos agroalimentarios cuyo valor de mercado está vinculado a su proveniencia. Para ello, se aplicó este enfoque al aceite de oliva virgen y los piñones, como casos de estudio. En el caso del aceite, el método se empleó para clasificar aceites de oliva virgen italianos frente a no italianos, así como para diferenciar entre los producidos en tres de las principales regiones productoras italianas. En cuanto a los piñones, se utilizó para distinguir entre piñones españoles y asiáticos, y para discriminar entre piñones de P. pinea procedentes de dos regiones españolas: España central (Castilla y León y Comunidad de Madrid) y Cataluña.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Muestras de aceite de oliva virgen y de piñones
El estudio se basó en el análisis de dos matrices alimentarias de alto valor: aceites de oliva vírgenes y piñones, seleccionadas por su relevancia comercial y diversidad geográfica. En total se analizaron 393 AOV trazables, procedentes de distintas regiones y campañas (2016–17 a 2019–20). La mayoría de las muestras fueron de origen italiano (n = 242), recogidas en regiones como Apulia (n = 73), Calabria (n = 58), Sicilia (n = 40) y otras regiones (n = 45), mientras que 26 no especificaban región. Las muestras no italianas (n = 151) incluyeron aceites de España (n = 51), Grecia (n = 39), Portugal (n = 23), Turquía (n = 21) y Túnez (n = 17) (Torres-Cobos et al., 2025a). Este conjunto presentó una amplia variabilidad en cultivares, productores y métodos de elaboración, lo que permitió evaluar la aplicabilidad de las técnicas analíticas bajo condiciones reales. Las muestras se conservaron a -20 °C en atmósfera de nitrógeno (N₂) hasta su análisis.
Complementariamente, se analizaron 253 muestras de piñones obtenidas entre 2020 y 2023 en el marco del proyecto TRACENUTS (PID2020-117701RB-I00). De ellas, 83 correspondían a piñones comerciales procedentes de China (n = 53), Rusia (n = 22) y Turquía (n = 8). Según la distribución natural de especies, se asumió que los piñones de China y Rusia correspondían principalmente a P. koraiensis y P. sibirica, mientras que los de Turquía podían incluir también P. pinea junto con Pinus Brutia, entre otras. Las 170 muestras restantes fueron piñones trazables de P. pinea cosechados en España (zona centro, n = 96; Cataluña, n = 74), suministradas por organismos oficiales (Torres-Cobos et al., 2025b). Todas las muestras fueron secadas según el estándar UNECE DDP-12 (2013) y conservadas a 4 °C hasta el análisis.
2.2. Análisis de los terpenos volátiles
El perfil de compuestos terpénicos volátiles (monoterpenos y sesquiterpenos) de las muestras de aceite de oliva y de piñón se obtuvo mediante GC-MS, tras una extracción en espacio de cabeza con HS-SPME, con adaptaciones según la matriz. Se pesaron 2 g de aceite o aproximadamente 1g de piñones enteros en un vial de 10 mL provisto de un septo de PTFE/silicona. La muestra se acondicionó a 70 °C durante 10 minutos. A continuación, se expuso una fibra de divinilbenceno/ carboxeno/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) de 2 cm de longitud y 50/30 μm de espesor de película (Supelco, Bellefonte, Pensilvania, EE. UU.) al espacio de cabeza de la muestra durante 60 minutos, manteniendo la misma temperatura. Posteriormente, la fibra se desorbió en el inyector cromatográfico a 260 °C durante 10 minutos. Los mono- y sesquiterpenos se separaron en en una columna capilar Supelcowax-10 (60 m × 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 μm de espesor de película) (Supelco, Bellefonte, Pensilvania, EE. UU.) instalada en un cromatógrafo de gases Agilent 6890 N (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.). El programa de temperatura de la columna fue el siguiente: 40 °C durante 3 minutos, incrementando hasta 100 °C a 4 °C/min, hasta 200 °C a 5 °C/min y finalmente hasta 260 °C a 15 °C/min, manteniéndose esta última temperatura durante 5 minutos. Para la determinación de los analitos utilizó un analizador de masas de cuadrupolo Agilent 5975C Inert MSD. La adquisición de datos se realizó en modo de monitoreo de iones seleccionados (Selected Ion Monitoring, SIM), registrando el cromatograma de iones extraídos (Extracted Ion Chromatograms, EICs) de 7 iones característicos de compuestos mono- y sesquiterpénicos, m/z 93, 95, 119, 159, 161, 189 y 204.
2.3. Enfoque fingerprinting: tratamiento de datos y quimiometría
Posteriormente, se aplicó un enfoque de fingerprinting utilizando las intensidades de los escaneos registrados en los EICs. Para cada ion se construyó una matriz de datos, en la que las filas correspondían a las muestras analizadas y las columnas a las intensidades de los escaneos de cada EIC. Cada EIC se normalizó para corregir posibles diferencias entre análisis, y las matrices de cada ion se alinearon entre sí mediante el algoritmo Correlation Optimized Warping (COW), implementado en Matlab® (Nielsen et al., 1998), con el fin de corregir los desplazamientos en el tiempo de retención entre muestras. Finalmente, para cada alimento objeto de estudio, las 7 matrices EIC alineadas se concatenaron para formar una única matriz bidimensional desplegada (two-way unfolded matrix).
Las matrices de datos obtenidas para aceites de oliva vírgenes y piñones se utilizaron por separado para construir y validar modelos de clasificación PLS-DA, empleando el software SIMCA v13.0© (Sartorius, Gotinga, Alemania).
Para aceites de oliva, se desarrollaron dos tipos de modelos de clasificación:

i) un modelo binario ITA/no ITA para diferenciar aceites de oliva virgen producidos en Italia de aquellos elaborados en otros cinco países mediterráneos.
ii) un modelo multiclase regional para discriminar entre tres regiones italianas productoras: Apulia, Calabria y Sicilia.
Para piñones, también se realizó una discriminación a dos niveles:
i) un modelo geográfico multiespecie para discriminar entre piñones procedentes de España (P. pinea) (ESP) y los de otras especies originarias de China, Rusia y Turquía (no ESP),
ii) un modelo geográfico específico para P. pinea con el objetivo de clasificar las muestras españolas según su región de producción: Cataluña (CAT) y España central (Castilla y León y Comunidad de Madrid, EC).
Para cada tipo de modelo de autenticación, las muestras se dividieron mediante un muestreo aleatorio estratificado en un conjunto de entrenamiento (80 %) y otro de validación (20 %). Este proceso se repitió tres veces para evaluar la influencia de la composición muestral y aumentar la robustez de la validación externa. Con cada conjunto de entrenamiento, se construyó un modelo PLS-DA, calibrado y validado internamente mediante validación cruzada dejando fuera el 10 % de los datos en cada iteración. Se seleccionaron el número óptimo de variables latentes (LV) y el preprocesado más adecuado (centrado en la media y escalado a varianza unitaria) en base al menor error cuadrático medio de validación cruzada (Root Meaan Square Error in cross validation, RMSEcv). Además, se evaluó el sobreajuste mediante pruebas de permutación (n = 20) y análisis ANOVA de los residuos predictivos validados.
Finalmente, cada modelo fue validado externamente con su conjunto de validación correspondiente, no utilizado en la fase de entrenamiento. Así, se generaron tres modelos y tres validaciones externas por cada tipo de modelo, lo que garantizó resultados más robustos y no dependientes de muestras concretas.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los modelos de clasificación desarrollados mediante el análisis de fingerprinting de terpenos volátiles demostraron una alta eficacia para la autenticación geográfica a distintos niveles, de país y regional, tanto en aceites de oliva virgen como en piñones. Los modelos PLS-DA, validados externamente con conjuntos de muestras independientes, ofrecieron resultados altamente robustos y consistentes.


3.1. Autenticación de aceites de oliva
Los modelos PLS-DA desarrollados con datos de fingerprinting terpénico (Figura 1a) permitieron distinguir aceites de oliva virgen italianos (ITA) de otros orígenes (no-ITA) con una exactitud del 91,7 % en validación externa (Tabla 1) (Torres-Cobos et al., 2025a). Esta elevada capacidad discriminante confirma la eficiencia observada en estudios anteriores desarrollados con el mismo enfoque para distinguir aceites de oliva virgen según su origen comunitario, extracomunitario o denominación de origen protegida (Quintanilla-Casas et al, 2022a; 2022b). Cuando se abordó la clasificación regional dentro de un mismo país (Figura 1b), los modelos de clasificación mantuvieron un elevado porcentaje de correcta clasificación de las muestras, siempre cercano al 80 % (Tabla 2). Específicamente, los aceites de Calabria alcanzaron un 83,3 % de correcta clasificación, mientras que los de Sicilia mostraron un porcentaje de acierto del 79,2 %, posiblemente condicionada por una representación ligeramente menor en el conjunto de entrenamiento.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la alta eficacia del fingerprinting terpénico como herramienta para la autenticación geográfica del aceite de oliva virgen. Su capacidad discriminante adquiere aún mayor relevancia si se tiene en cuenta que el estudio se realizó en un contexto especialmente complejo. Por un lado, se abordó la diferenciación de aceites italianos frente a un conjunto muy diverso de aceites de distintos países productores, que incluía muestras de varios años de cosecha, distintas variedades, orígenes y métodos de extracción. Por otro lado, se planteó el reto adicional de distinguir entre regiones italianas cercanas entre sí y con características agronómicas y varietales similares. Este escenario ofreció un marco exigente y representativo para validar la metodología, permitiendo evaluar de forma rigurosa su eficacia en condiciones reales de aplicación.
3.2. Autenticación de piñones
En el estudio paralelo con piñones, se obtuvieron resultados igualmente satisfactorios. El modelo binario multiespecie para diferenciar entre piñones mediterráneos y asiáticos logró una clasificación del 100 % en validación externa al diferenciar la totalidad de piñones españoles de P. pinea frente a otras especies de origen chino, ruso y turco (Tabla 1) (Torres-Cobos et al., 2025b). Este nivel de eficiencia, sin errores de clasificación ni desviaciones, pone de manifiesto la capacidad del perfil de terpenos volátiles para identificar fraudes potenciales, independientemente de la marca comercial, la campaña de cosecha o la zona concreta de producción.
En un escenario aún más exigente, como la discriminación regional entre piñones de la misma especie (P. pinea) procedentes de Cataluña y de la España central (Castilla y León y Comunidad de Madrid), el modelo mantuvo una tasa de clasificación correcta del 99 % en validación externa, con solo una muestra mal asignada (Tabla 2). Este resultado demuestra la alta sensibilidad del enfoque incluso para distinguir entre producciones geográficamente próximas y genéticamente similares.

En conjunto, estos hallazgos validan la utilidad del fingerprinting terpénico como herramienta eficaz para verificar tanto la identidad botánica como el origen geográfico de piñones en productos de alto valor añadido, incluso en contextos reales y con alta variabilidad de muestras. Además de proporcionar una base sólida para su implementación en sistemas de control de autenticidad, esta metodología abre nuevas líneas de investigación. Entre ellas, cabe destacar la ampliación del modelo con muestras de otras regiones y especies, así como la evaluación de su capacidad para detectar mezclas de distintas procedencias o para aplicarse en matrices alimentarias complejas y productos procesados.
4. CONCLUSIONES
El fingerprinting de terpenos volátiles y semivolátiles ha demostrado ser una metodología eficaz, versátil y robusta para la autenticación geográfica de alimentos, como se evidenció en su aplicación tanto en aceites de oliva virgen como en piñones. Los modelos PLS- DA desarrollados a partir de esta técnica permitieron identificar patrones composicionales estrechamente vinculados al origen geográfico y/o a la especie botánica, minimizando al mismo tiempo la influencia de factores variables como la campaña de cosecha, el productor o el método de procesado. En conjunto, la solidez del método frente a la variabilidad interanual y su sensibilidad para detectar falsificaciones abren nuevas posibilidades de aplicación en sistemas de control de calidad, trazabilidad alimentaria y protección del consumidor, contribuyendo a garantizar la autenticidad y transparencia en la cadena alimentaria
Es muy importante destacar que la implementación de esta metodología se caracteriza por su rapidez, simplicidad y alta eficiencia, por su casi nula preparación de muestra y por no utilizar reactivos ni disolventes, lo que lo convierte en una herramienta adecuada para su aplicación en laboratorios de rutina. Además, su uso como técnica de cribado puede contribuir a orientar las inspecciones oficiales, fortaleciendo la protección del consumidor y la integridad de productos con alto valor comercial.
A la luz del sólido potencial mostrado por el fingerprinting terpénico para la autenticación geográfica en diversas matrices alimentarias, resulta imprescindible fomentar su transferencia tecnológica y avanzar hacia su estandarización. Esto permitiría afrontar con mayor solvencia desafíos analíticos más complejos, como la identificación de mezclas de distintos orígenes, la autenticación en productos transformados o multicomponente, y su aplicación en una gama más amplia de alimentos vulnerables al fraude.
5. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se llevó a cabo en el marco del proyecto TRACENUTS, PID2020-117701RB-I00, financiado por el MICIU/AEI/10.13039/501100011033. B.Torres-Cobos agradece al Ministerio de Universidades la financiación de su beca predoctoral FPU20/01454. Los autores del INSA-UB forman parte del Grupo Consolidado de Investigación LiBiFOOD (2021-SGR-00854), reconocido por AGAUR (Generalitat de Catalunya). INSA-UB es además una Unidad de Excelencia María de Maeztu (subvención CEX2021-001234-M), financiada por el MICIU/AEI/10.13039/501100011033. Los autores desean expresar su agradecimiento al INIA-CIFOR y a CESEFOR por la cesión de muestras de P. pinea procedentes de Madrid y Castilla y León. Asimismo, los autores agradecen a Unaprol – Italian Olive Consortium – su colaboración en la recogida de muestras de aceite de oliva virgen italiano y el apoyo financiero prestado.
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