INTRODUCCIÓN

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico asociado a diversas propiedades saludables, destacando sus efectos antihipertensivos, antidepresivos y reductores del colesterol ¹. Por otro lado, la riboflavina, o vitamina B2, es una vitamina esencial que participa en los procesos antioxidantes y se considera un posible agente neuroprotector ².
Las bacterias del ácido láctico (BAL) son un grupo de microorganismos que se han usado durante miles de años para producir una amplia variedad de alimentos fermentados³. Más recientemente, se ha reconocido la capacidad de algunas cepas de BAL de mejorar la salud del hospedador. La síntesis de GABA y riboflavina en bacterias lácticas (BAL) está condicionada a la presencia en el genoma de los operones gad y rib, respectivamente.

En el primer caso, la producción de GABA en BAL constituye un mecanismo de protección contra la acidez, ya que la transformación del glutamato en GABA consume un protón, lo que provoca un aumento del pH intracelular ⁴.

Aunque se han seleccionado cepas de BAL productoras de GABA, con el objetivo de elaborar alimentos fermentados enriquecidos en GABA, la mayoría de las cepas productoras naturales de riboflavina no son capaces de producir esta vitamina con altos rendimientos. Sin embargo, es posible obtener cepas mutantes espontáneas superproductoras de riboflavina mediante su exposición a un análogo de la riboflavina denominado roseoflavina ⁵.

Las bebidas vegetales han ganado popularidad en todo el mundo gracias a sus propiedades nutricionales, así como a su idoneidad para vegetarianos y personas con alergia a la proteína de la leche o intolerancia a la lactosa. Por otro lado, estas bebidas son excelentes vehículos para prebióticos, probióticos y/o postbióticos. En este estudio hemos analizado la capacidad de producción de GABA y riboflavina por distintas cepas de BAL, así como la aplicación de cepas previamente seleccionadas productoras de estos compuestos ^6,7 , con el objetivo de elaborar bebidas funcionales fermentadas de soja y avena enriquecidas con ambas sustancias simultáneamente. 

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas

Las cepas utilizadas en este trabajo pertenecen a las colecciones del INIA-CSIC y del IATA- CSIC (Tabla 1). Las cepas de Lactiplantibacillus y Limosilactobacillus se cultivaron en caldo MRS a 37°C en condiciones anaeróbicas. Las cepas de Apilactobacillus y Fructobacillus se cultivaron en caldo MRS suplementado con 10 g/L de fructosa a 30°C. Las cepas de Lactococcus se cultivaron en caldo M17 suplementado con 5 g/L de glucosa a 30°C.

Identificación de nuevas cepas productoras de GABA

La capacidad de producción de GABA se determinó mediante la incubación de las cepas en medio de cultivo suplementado con glutamato monosódico (GMS) 3,5% durante 48h ⁶. Posteriormente, el GABA presente en los sobrenadantes fue cuantificado mediante el ensayo GABase ⁸.

Identificación de nuevas cepas productoras de riboflavina y generación de mutantes superproductores

La evaluación de la producción de riboflavina se llevó a cabo realizando cinco subcultivos consecutivos en medio deficiente en riboflavina (RAM) con lavado previo de las células. La concentración de riboflavina se estimó mediante fluorescencia directa usando el sobrenadante del cultivo final ⁷. Aquellas cepas  que produjeron riboflavina fueron sometidas a concentraciones crecientes de roseoflavina (hasta 200 mg/L) en medio RAM, para obtener mutantes espontáneos capaces de producir mayores rendimientos de riboflavina.

Fermentación de bebidas de soja y avena con cepas seleccionadas

Las cepas seleccionadas se inocularon individualmente y mediante combinaciones optimizadas a una concentración de 7 log ufc/mL en bebidas de soja y avena comerciales, ambas suplementadas con 0,2% de GMS durante 48h. Se incluyó un control no inoculado de cada bebida. Tras 48 h de fermentación, se determinó el pH, recuento microbiano y se determinó la concentración de GABA y riboflavina en las bebidas.

Se preparó un curva patrón de GABA (0-50 mM) en bebidas de soja y avena sin fermentar. Las fermentaciones se realizaron al menos por duplicado en dos experimentos independientes.

Preparación de extractos y cuantificación de riboflavina de las bebidas vegetales fermentadas

Las bebidas vegetales fermentadas y control se mezclaron (1:1 v/v) con ácido acético glacial 1%, se hirvieron a 100°C durante 5 min y, posteriormente, se centrifugaron a 12000 g durante 10 min. La extracción se realizó por duplicado para cada muestra y los sobrenadantes se analizaron mediante cuantificación por fluorescencia directa ⁷, utilizando una curva patrón con sobrenadantes de bebidas de soja y avena con cantidades conocidas de riboflavina comercial (0-10 mg/L).

Preparación de extractos y determinación de la concentración de GABA en bebidas vegetales fermentadas

En este caso, para la extracción de GABA, las bebidas fermentadas y control se diluyeron 1:5 en metanol al 70%, y se incubaron a 50°C durante 1 h con agitación continua. Posteriormente, tras una incubación en un baño de agua ultrasónico durante 30 min a temperatura ambiente, los extractos se centrifugaron a 12000 g durante 20 min, los sobrenadantes se filtraron mediante filtros de 0,22 μm y se analizaron mediante HPLC-ESI/MS. Todos los extractos de las muestras y las soluciones estándar se inyectaron a un volumen de 2 μL en una columna Infinity Lab Poroshell 120 EC- C18 a 30°C.

Los sistemas de disolventes fueron ácido fórmico al 0,1% (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% diluido en acetonitrilo (disolvente B).

El gradiente de elución utilizado fue (tiempo, % de disolvente B): 5 min, 5%; 15 min, 60%; 16 min, 80%; 20 min, 80%, 22 min, 5%, 30 min, 5%. La identificación se realizó mediante la comparación de la fórmula molecular, el tiempo de retención y referencias previas. La cuantificación se realizó mediante curvas de calibración con GABA en extractos de bebidas de soja o avena.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.). Los datos se analizaron mediante ANOVA con un modelo lineal general y se empleó la prueba de Tukey para comparar las medias con un intervalo de confianza del 95%. 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Selección de cepas productoras de riboflavina y GABA

Veinticinco cepas, incluidas cuatro cepas caracterizadas en trabajos previos ^6,7 fueron analizadas por su capacidad para producir riboflavina en medio RAM (Tabla 1). La mayoría de las cepas lograron producir la vitamina en estas condiciones, incluyendo cepas fructofílicas de Fructobacillus tropaeoli, siendo esta la primera vez que se describe la producción de riboflavina en esta especie.

Las cepas productoras de riboflavina identificadas en este estudio se expusieron posteriormente a concentraciones crecientes de roseoflavina. Tres de las 14 cepas sometidas a este tratamiento dieron lugar a colonias resistentes a 200 mg/L de roseoflavina (F. tropaeoli Sp01-R, L. plantarum Al03-R, y L. plantarum Mu02-R), y en todas ellas se analizó la producción de riboflavina en medio RAM (Tabla 1). La exposición a roseoflavina se ha empleado con éxito para la selección de mutantes espontáneos sobreproductores de  riboflavina. En todos estos casos, la secuenciación del ADN de cepas mutantes seleccionadas reveló cambios en la región reguladora del operón rib, lo que afectó su expresión ⁹.

Por lo tanto, las cepas resistentes a la roseoflavina obtenidas en este estudio pueden considerarse mutantes espontáneos, ya que exhiben una producción de riboflavina significativamente superior a la de sus respectivas cepas parentales. L. plantarum Mu02-R mostró producción de riboflavina en cantidades similares a las detectadas previamente en otros mutantes espontáneos, como L. fermentum INIA P143-R y L. plantarum DTA 369-R ⁷, mientras que L. plantarum Al03-R exhibió los rendimientos más altos de riboflavina (Tabla 1). Por tanto, estas cuatro cepas de mutantes espontáneos fueron seleccionadas como superproductoras de riboflavina para los siguientes ensayos en bebidas vegetales.

En cuanto a la producción de GABA, L. lactis Li03 mostró niveles equivalentes a los descritos previamente en cepas con alta producción ⁶ y fue seleccionada, para la fase posterior del estudio, junto con L. lactis INIA Z108, L. lactis INIA Z174 y L. plantarum DTA 369 (Tabla 1). Desafortunadamente, los niveles de GABA detectados en los mutantes productores de riboflavina fueron bajos, lo que dificultó la obtención de ambos compuestos a partir de una sola cepa.

Producción de riboflavina y GABA en bebidas de soja y avena por cepas individuales seleccionadas

Se seleccionaron, por tanto, cuatro mutantes espontáneos con alta capacidad para producir riboflavina y otras cuatro cepas con altos niveles de producción de GABA (Tabla 2-3) para llevar a cabo la fermentación de bebidas de soja y avena suplementadas con GMS 0,2%. Todas las cepas inoculadas lograron desarrollarse en las bebidas vegetales, alcanzando densidades celulares superiores a 8,5 log ufc/mL (Tabla 2-3).

Además, la fermentación provocó una disminución significativa del pH en comparación con las bebidas control, con valores finales de pH entre 3,0 y 3,7 en la bebida de avena y alrededor de 4,5 en la bebida de soja, con la excepción de la fermentada con L. fermentum INIA P143-R, que alcanzó un pH superior a 5,0 (Tabla 2).

En la bebida de soja, las cuatro cepas mutantes espontáneas mostraron un patrón de producción de riboflavina similar al observado en medio de cultivo RAM (Tabla 2). En consecuencia, los niveles más altos de riboflavina se alcanzaron con L. plantarum Al03-R y L. fermentum INIA P143-R.

Sin embargo, la producción de GABA fue menor que en medio de cultivo, con la  excepción de las bebidas fermentadas por L. plantarum Mu02-R, el cual produjo pequeñas cantidades de GABA en la bebida de soja, mientras que la producción no fue detectable en medio de cultivo. Por el contrario, L. plantarum DTA 369, que había mostrado los niveles más altos de GABA en medio de cultivo, produjo cantidades muy limitadas en soja, a pesar de la suplementación de la bebida con GMS. L. lactis INIA Z174 produjo los mayores rendimientos de GABA en la bebida de soja (Tabla 2).

Por otro lado, L. plantarum Al03-R mostró una mejor producción de riboflavina en bebida de avena, alcanzando 3,81 mg/L (Tabla 3), comparable a los niveles alcanzados en medio RAM. Además, las tres cepas de L. lactis mostraron una mejor producción de GABA en la bebida de avena, superando el rendimiento observado en la bebida de soja (Tabla 3).

Al igual que en la bebida de soja, tampoco se detectó GABA en la bebida de avena fermentada con L. plantarum DTA369-R a pesar de los buenos resultados exhibidos en el caldo de cultivo.

La producción de GABA es un mecanismo útil en BAL para resistir el bajo pH generado durante la fermentación. Por lo tanto, la mayor producción de GABA en la bebida de avena podría estar relacionada con los valores de pH más bajos alcanzados después de la fermentación.

Sin embargo, debido a que la producción de GABA en la bebida de avena no alcanzó los niveles producidos por las cepas seleccionadas en medio de cultivo, es posible que otros factores específicos de la cepa o componentes de la matriz fermentada influyan en la producción de GABA en las bebidas vegetales.

Las bebidas comerciales utilizadas en este estudio carecían de azúcares añadidos en su composición. Al comparar la información de composición nutricional proporcionada de estas bebidas comerciales, el contenido de azúcar en la bebida de avena (5,5 g/100 mL) fue mucho mayor que en la bebida de soja (0,8 g/100 mL).

En este sentido, la suplementación con glucosa u otras fuentes de carbono se ha utilizado como estrategia para optimizar la producción de riboflavina o GABA durante la fermentación por BAL. Por el contrario, el contenido de proteína en la bebida de soja (3,6 g/100 ml), fue superior que en la bebida de avena (0,7 g/100 ml). Sin embargo, el contenido de proteína aparentemente no fue un factor limitante del crecimiento, ya que se observaron niveles similares de ufc/mL en ambas bebidas (Tabla 2-3). Si bien la disponibilidad de proteína podría influir en la producción de GABA, es probable que este no fuera un elemento esencial en los ensayos realizados, ya que todas las bebidas se suplementaron con 0,2% de GMS.

Producción de GABA y riboflavina en bebidas de soja y avena mediante combinaciones de cepas seleccionadas

Debido a la capacidad individual de L. lactis INIA Z174 para producir GABA y de los mutantes resistentes a roseoflavina L. plantarum Al03-R y L. fermentum INIA P143-R para producir riboflavina, se diseñaron dos combinaciones de cepas con el objetivo de enriquecer las bebidas vegetales en GABA y riboflavina simultáneamente (Tabla 2-3).

En ambas combinaciones, las cepas co-cultivadas alcanzaron valores de crecimiento y pH similares a los cultivos individuales (Tabla 2-3). La fermentación de la bebida de soja co-fermentada con L. lactis INIA Z174 y L. plantarum Al03-R resultó en una producción superior de GABA, pero no significativa, en comparación con L. lactis INIA Z174, aunque los niveles de riboflavina fueron inferiores a los obtenidos con L. plantarum Al03-R (Tabla 2).

Por el contrario, esta combinación de cepas permitió obtener en la bebida de avena mayores niveles significativos tanto de riboflavina como de GABA (Tabla 3). En cambio, la combinación L. lactis INIA Z174 y L. fermentum INIA P143-R, tanto en la bebida de soja como en avena, exhibió valores inferiores de riboflavina que los alcanzados individualmente con L. fermentum INIA P143-R, mientras que los niveles de GABA fueron similares a los obtenidos por L. lactis Z174 (Tabla 2-3).

La aplicación tecnológica de cepas de BAL co-cultivadas ofrece nuevas oportunidades para el desarrollo de alimentos funcionales, donde las interacciones metabólicas entre las cepas pueden jugar un papel clave. Estudios previos han descrito mejores rendimientos en la producción de GABA por BAL en co-cultivos ⁴, y se han hipotetizado diferentes mecanismos para este aumento, destacando el ajuste al pH óptimo, la actividad proteolítica, o la producción de metabolitos que podrían impulsar el crecimiento y/o la producción de GABA. En esta línea, se ha descrito un aumento en la producción de GABA por Enterococccus faecium AB157 co-cultivada con Saccharomyces cerevisiae SC125, atribuido a la regulación positiva en las vías biosintéticas de GABA y quorum sensing durante la co-fermentación ¹⁰.

De manera similar a la combinación de L. lactis INIA Z174 y L. plantarum Al03-R en bebidas de avena, se han descrito mejores rendimientos en la producción de riboflavina en bebidas de coco y avena fermentadas con la combinación de Limosilactobacillus reuteri AMBV339 y Streptococcus thermophilus LMG18311, aunque no se han desvelado los posibles mecanismos implicados ¹¹.

Aunque la bibliografía previa describe el desarrollo de bebidas fermentadas de soja o avena enriquecidas en GABA o riboflavina mediante la aplicación de cepas de BAL no modificadas genéticamente, éste es el primer estudio en el que la aplicación de cepas de BAL ha permitido la elaboración de bebidas vegetales enriquecidas simultáneamente en GABA y riboflavina.

Las mayores concentraciones de GABA y riboflavina se detectaron en bebidas de avena fermentadas con la combinación de L. lactis INIA Z174 y L. plantarum Al03-R, obteniéndose 9,5 mM (0,98 g/L) de GABA y 4,72 mg/L de riboflavina.

Diversos estudios han descrito dosis eficaces de GABA para obtener beneficios para la salud, entre 2 y 300 mg al día, durante 1 a 12 semanas ¹². Por otro lado, la ingesta diaria promedio de referencia de riboflavina para la población se establece en 1,3 mg/ día según la EFSA. Por lo tanto, 200 ml de la bebida de avena fermentada, elaborada en este estudio, aportaría al menos 196 mg de GABA y 0,94 mg de riboflavina al día, proporcionando una dosis relevante de GABA y cubriendo más del 70% del requerimiento diario promedio de riboflavina.

CONCLUSIÓN

En este estudio se han desarrollado las primeras bebidas de soja y avena enriquecidas en GABA y riboflavina mediante co-fermentación con cepas de BAL seleccionadas. La fermentación de una bebida de avena mediante la combinación de L. lactis INIA Z174 y L. plantarum Al03-R resultó en unas cantidades de GABA y riboflavina que podrían sustentar efectos saludables. La optimización de las condiciones de fermentación será el paso necesario para el desarrollo de una bebida funcional comercial producida con esta combinación de cepas y enriquecida con GABA y riboflavina.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el proyecto PID2020- 119630RB-I00 del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidad de España. Se reconoce la acreditación del IATA-CSIC como Centro de Excelencia Severo Ochoa CEX2021-001189-S. Se agradece a la Unidad de Servicio de Análisis del ICTAN el servicio de análisis de cromatografía y espectrometría de masas.
Recientemente se ha publicado una versión ampliada de este trabajo en la revista Innovative Food Science and Emerging Technologies (Langa y cols., 104: 104108, 2025; DOI: 10.1016/j.ifset.2025.104108). 

Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA - CSIC). Ctra. de La Coruña Km 7.5, 28040, Madrid. bInstituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC), Avenida Agustín Escardino 7, 46980, Paterna.
• José Antonio Curiel, científico titular, Tlf: 913476886; email: joseantonio.curiel@inia.csic.es / *autor correspondiente
• Susana Langa, científica titular, Tlf: 913473755; email: langa.susana@inia.csic.es / *autor correspondiente
• Ángela Peirotén, técnico superior especializado, Tlf: 913473995; email: angela.peiroten@inia.es 
• Vicente Monedero, investigador científico, Tlf: 963435174; email: vmon@iata.csic.es 
• Manuel Zúñiga, científico titular, Tlf: 963435175; email: manolo@iata.csic.es 
• Iván Palomino, contratado laboral fijo, Tlf: 913476863; email: ivan.palomino@inia.csic.es 
• Pilar Sabuquillo, contratada laboral fijo, Tlf: 913476863; email: mpsc@inia.csic.es 
• José María Landete, científico titular, Tlf: 913476933; email: landete.josem@inia.csic.es 

BIBLIOGRAFIA

1.Matsubara, F., Ueno, H., Tadano, K., Suyama, T., Imaizumi, K., Suzuki, T., Magata, K., Kikuchi, N., Muneyuki, K., Nakamichi, N., Kumagai, H., y Saruta, T. Effects of GABA supplementation on blood pressure and safety in adults with mild hypertension. Japanese Pharmacology and Therapeutics, 30, 963–972, 2002.

2.Marashly, E.T.,y Bohlega, S.A. Riboflavin has neuroprotective potential: Focus on Parkinson’s disease and migraine. Frontiers in Neurology, 8, 333, 2017.

3.Douglas, G.L., y Klaenhammer, T.R. Genomic evolution of domesticated microorganisms. Annual Review of Food Science and Technology, 1(1), 397-414, 2010.

4.Cui, Y., Miao, K., Niyaphorn, S., y Qu, X. Production of gamma-aminobutyric acid from lactic acid bacteria: A systematic review. International Journal of Molecular Sciences, 21(3), 995, 2020.

5.Vikram, M. V., Rana, A., y Ahire, J. J. Riboswitch-mediated regulation of riboflavin biosynthesis genes in prokaryotes. 3. Biotech, 12, 278, 2022.

6.Langa, S., Santos, S., Flores, J.A., Peirotén, A., Rodríguez, S., Curiel, J.A., y Landete, J.M. Selection of GABA- producing lactic acid bacteria strains by polymerase chain reaction using novel gadB and gadC multispecies primers for the development of new functional foods. International Journal of Molecular Sciences, 25, 13696, 2024.

7.Langa, S., Peirotén, A., Rodríguez, S., Calzada, J., Prieto-Paredes, R., Curiel, J.A., y Landete, J.M. Riboflavin bio-enrichment of soy beverage by selected roseoflavin-resistant and engineered lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 411, 110547, 2024.

8.Tsukatani, T., Higuchi, T., y Matsumoto, K. Enzyme-based microtiter plate assay for γ-aminobutyric acid: Application to the screening of γ-aminobutyric acid- producing lactic acid bacteria. Analytica Chimica Acta, 540(2), 293–297, 2005.

9.Lee, E.R., Blount, K.F., y Breaker, R.R. Roseoflavin is a natural antibacterial compound that binds to FMN riboswitches and regulates gene expression. RNA Biology, 6(2), 187–194, 2009.

10.Tan, X., Zhang, Q., Liu, J., Shang, Y., Min, Y., Sun, X., y Tang, J. Enhanced γ-aminobutyric acid production by co-culture fermentation with Enterococcus faecium AB157 and Saccharomyces cerevisiae SC125. LWT- Food Science and Technology, 208, 116739, 2024.

11.Spacova, I., Ahannach, S., Breynaert, A., Erreygers, I., Wittouck, S., Bron, P.A., Van Beeck, W., Eilers, T., Alloul, A., Blansaer, N., Vlaeminck, S.E., Hermans, N., y Lebeer, S. Spontaneous riboflavin-overproducing Limosilactobacillus reuteri for biofortification of fermented foods. Frontiers in Nutrition, 9(9), 916607, 2022.

12.Lee, X.Y., Tan, J.S., y Cheng, L.H. Gamma Aminobutyric Acid (GABA) enrichment in plant-based food–A mini review. Food Reviews International, 39(8), 5864–5885, 2022