^{1Celia M. Cantín1, Juliana Navarro2, Pedro Gabriel Martínez1,2, Pedro Marco2}

^{1Grupo NPFC, Estación Experimental de Aula Dei (CSIC), Zaragoza
2Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), Zaragoza}

INTRODUCCIÓN

Las podredumbres postcosecha en la fruta causan enormes pérdidas económicas cada año (Elshafie et al., 2015). Estas podredumbres suelen estar causadas en su mayoría por hongos, entre los que podríamos destacar aquellas infecciones causadas por hongos de las especies Penicillium spp., Alternaria spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Botrytis spp., Monilinia spp., Collectotrichum spp., Fusarium spp. y Verticillium spp.

El modo clásico de lucha contra este tipo de patologías es la utilización de fungicidas de síntesis tanto en la etapa precosecha como en la postcosecha. Sin embargo, la aparición de cepas resistentes, las limitaciones legales, el detrimento de su efectividad, sus consecuencias negativas en la salud y la naturaleza (El Khetabi et al., 2021; Camele et al., 2012; Venturini et al., 2002) y la concienciación por parte del consumidor en la búsqueda de productos libres de sustancias químicas, ha impulsado la búsqueda de alternativas para la conservación postcosecha de fruta fresca.

Entre las alternativas actualmente estudiadas encontramos la utilización de aceites esenciales (AEs) extraídos de plantas aromáticas. Los AEs son líquidos oleosos, volátiles y olorosos con propiedades antimicrobianas. Son considerados compuestos GRAS (Generally Recognized As Safe) (Yan et al., 2020), seguros para el consumo alimentario y que no dejan ningún residuo en el fruto. Suelen tener composiciones muy complejas, y en ellas destacan distintos compuestos activos como linalol, eugenol, timol, carvacrol, citral y eucaliptol. Algunos de los AEs que más se están estudiando para su utilización en la postcosecha de distintas frutas son los obtenidos del orégano, la canela, el tomillo, la menta, el romero, el clavo, la lavanda y la salvia.

En el trabajo que presentamos, nuestro objetivo fue la utilización de AEs de plantas aromáticas provenientes de Aragón (Fig. 1) como alternativa a los fungicidas de origen químico para la conservación de manzana fresca. Para ello llevamos a cabo una parte de ensayos in vitro y otra in vivo, en las cuales se trabajó con AEs de Mentha rotundifolia, Origanum virens, Salvia officinalis y Valeriana officinalis, para los que se evaluó su capacidad antifúngica frente a los hongos Monilinia fructicola, Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Rhizopus stolonifer y Penicillium expansum.

MATERIAL Y MÉTODOS

El estudio in vitro consistió en evaluar la eficacia antifúngica de los AEs obtenidos de M. rotundifolia, O. virens, S. officinalis y V. officinalis frente a los hongos M. fructicola, B. cinerea, A. alternata, P. expansum y R. stolonifer (Fig. 2). Se utilizaron diferentes métodos para la evaluación de esta capacidad antifúngica como la difusión de AEs en disco, la dilución de AEs en agar patata dextrosa (PDA), la dilución de AEs en caldo de patata dextrosa (PBD) y la generación de esporas en agar dicloran rosa de bengala cloranfenicol (DRBD).

Posteriormente, se evaluó in vivo la eficacia antifúngica de los AEs procedentes de M. rotundifolia, O. virens y V. officinalis frente los mismos hongos, determinado su capacidad antifúngica postcosecha tras su aplicación sobre manzanas ‘Golden Delicious’ recién cosechadas. Previamente a comenzar el ensayo, se desecharon aquellos frutos afectados con cualquier tipo de herida, golpe o abrasión superficial. Posteriormente, la superficie de los frutos se desinfectó sumergiendo las manzanas en agua con un 1 % de hipoclorito de sodio durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras un aclarado exhaustivo con agua, se dejaron secar totalmente a 20ºC antes del ensayo.

En la zona ecuatorial de cada uno de los frutos, se realizaron dos heridas de unos 2 mm de diámetro, perforando la pulpa del fruto con una aguja estéril (Fig. 3). Para cada uno de los tratamientos con AEs, se inocularon 30 μL de la suspensión al 0,5 % del AE correspondiente en la herida de la izquierda; y 30 μL de la disolución al 5 % del mismo aceite en la herida de la derecha. Se mantuvieron a temperatura ambiente durante 1 hora y seguidamente se inocularon 20 μL de la suspensión del microorganismo correspondiente en cada una de las heridas. Tras la inoculación, las manzanas fueron almacenadas en arcones de plástico herméticos con papel humedecido en su interior con el fin de mantener una alta humedad relativa y facilitar el crecimiento del hongo. Tras 3, 7 y 10 días, se midió el diámetro del daño generado por el hongo.

Los AEs de M. rotundifolia, O. virens y S. officinalis fueron obtenidos en el Laboratorio de Plantas Aromáticas del CITA en una planta de destilación semi industrial mediante destilación por arrastre de vapor. Esta extracción fue realizada en un rango de presión de vapor de 0,5 a 1 bar. El AE de V. officinalis fue adquirido comercialmente. A partir de estos AEs se realizaron suspensiones de concentración 0,5 % y 5 %, utilizando Tween 80 como diluyente (0,05 %) y etanol (3 %) junto a agua estéril (Venturini et al., 2002).

La cepa de M. fructicola fue cedida por el grupo de Patología Postosecha del Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentarias (IRTA). Las cepas de B. cinerea, A. alternata, P. expansum y R. stolonifer fueron obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Estas cepas se reaislaron en placas de Petri con PDA para verificar que se trataba de cultivo puro, y obtener un stock de referencia suficiente para los ensayos a realizar. Las cepas de referencia y su stock se mantuvieron en una estufa a 24°C. El inóculo de cada uno de los hongos se obtuvo mediante raspado superficial, con asa de siembra estéril, de placas Petri con PDA cuyo grado de esporulación estaba en un estado avanzado. Las esporas y micelio obtenidos se depositaron en un tubo con agua destilada estéril, y se ajustaron las concentraciones a 104 esporas/mL. Esta suspensión final se repartió en alícuotas de 1,5 mL que se mantuvieron en refrigeración hasta su utilización.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Evaluación in vitro
En el ensayo de difusión de AEs en disco, todos los AEs fueron efectivos, en mayor o menor medida, frente a A. alternata y M. fructicola. B. cinerea únicamente fue inhibido por S. officinalis, mientras que R. stolonifer mostró una alta resistencia, no siendo afectado por ninguno de los AEs ensayados.

En el ensayo de dilución de AEs en medio de cultivo PDA, todos los hongos fueron inhibidos frente a los AEs al 10 % de concentración, con la excepción del AE de S.officinalis, en cuyas placas se podía visualizar crecimiento de todos los hongos a excepción de M. fructicola.

En el ensayo de dilución en caldo PDB se determinó la MIC (concentración mínima inhibitoria) de los AEs frente a cada hongo. El MIC más habitual de los AEs contra los patógenos ensayados fue 0,25 %. Frente a M. fructicola, el MIC de O. virens y M. rotundifolia fue de 0,125 %. A. alternata mostró tener una mayor resistencia frente a los AEs con unos valores de MIC de O. virens y S. officinalis del 1 %.

En el ensayo de germinación de esporas en cultivo DRBC, M. fructicola fue inhibido por todos los AEs a concentraciones del 1 y 0,5 %. En el caso de B. cinérea, hubo efecto inhibitorio por parte del AE de O. virens y M. rotundifolia al 1% de concentración. A. alternata no presentó inhibición en la generación de esporas frente a ninguno de los 4 AEs.

Evaluación in vivo
Los ensayos in vivo determinaron que los AEs de plantas aromáticas tienen un potencial como tratamiento frente a la actividad antifúngica de los hongos más comunes en postcosecha. Sin embargo, y como se esperaba, el efecto antifúngico a las concentraciones estudiadas (entre 0.5 % y 5 %) es menor que el efecto antifúngico de los tratamientos realizados con fungicidad de síntesis.

El tratamiento con AE de M. rotundifolia al 5 % fue uno de los más efectivos entre los AEs probados, especialmente frente a las infecciones de A. alternata y P. expansum (Fig. 4). El tratamiento con O. virens al 5% y el de V. officinalis al 5 % también mostró un control de la infección de M. fructicola. Por otro lado, el AE de S. officinalis presentó una capacidad antifúngica menor que el resto de los AEs. Sin embargo, R. stolonifer resultó ser el hongo más resistente siendo el menos afectado por los AEs ensayados como control postcosecha.

CONCLUSIONES

Los resultados de este trabajo demostraron que los AEs de M. rotundifolia y O. virens al 5 % pueden ser una alternativa frente a los fungicidas químicos para el control de algunas de las podredumbres postcosecha más comunes en manzana. Por el contrario, el AE de S. officinalis demostró la menor capacidad antifúngica entre los AEs estudiados.

Los resultados de este trabajo mostraron también que la capacidad antifúngica de los AEs de plantas aromáticas, a las concentraciones a las que se puede trabajar con ellos sin tener efectos secundarios negativos en la fruta, es menor que la de los fungicidas de síntesis utilizados convencionalmente.

A pesar de ello, este trabajo demuestra que la utilización de AEs es actualmente una línea de investigación con un gran interés y potencial para su aplicación inmediata en la industria agroalimentaria por tratarse de un tratamiento natural, sin residuos, respetuoso con el medio ambiente y con la salud del consumidor, y perfectamente compatible con agricultura ecológica, la economía circular y la utilización de subproductos.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación del Grupo de Cooperación FrutAE del Programa de Desarrollo Rural para Aragón 2014- 2020 (Convocatoria 2021).

^{BIBLIOGRAFÍA}

^{(1) Elshafie, H.S., Mancini, E., Sakr, S., De Martino, L., Mattia, C.A., De Feo, V., Camele, I. (2015). Antifungal activity of some constituents of Origanum vulgare L. essential oil against postharvest disease of peach fruit. Journal of Medicinal Food, 18(8), pp. 929–934. doi:10.1089/jmf.2014.0167.
(2) El Khetabi, A., Ezrari, S., El Ghadraoui, L., Tahiri, A., Ait Haddou, L., Belabess, Z., Merah, O., Lahlali, R. (2021). In vitro and in vivo antifungal activities of nine commercial essential oils against brown rot in apples. Horticulturae, 7(12), pp. 545-563. doi:10.3390/horticulturae7120545.
(3) Camele, I., Altieri, L., De Martino, L., De Feo, V., Mancini, E., Rana, G.L. (2012). In vitro control of post-harvest fruit rot fungi by some plant essential oil components. International Journal of Molecular Sciences, 13(2), pp. 2290–2300. doi:10.3390/ijms13022290.
(4) Venturini, M.E., Blanco, D., Oria, R. (2002). In vitro antifungal activity of several antimicrobial compounds against Penicillium expansum. Journal of Food Protection, 65(5), pp.834–839. doi:10.4315/0362-028x-65.5.834.
(5) Yan, J., Wu, H., Shi, F., Wang, H., Chen, K., Feng, J. and Jia, W. (2020). Antifungal activity screening for mint and thyme essential oils against Rhizopus stolonifer and their application in postharvest preservation of strawberry and peach fruits. Journal of Applied Microbiology, 130(6), pp. 1993–2007. doi:10.1111/jam.14932.}