^{Pilar Colás-Medà. Doctora en Ciencia y Tecnología Agraria y Alimentaria. Investigadora postdoctoral del Departamento de Tecnología de Alimentos. Universitat de Lleida. 973702314 pilar.colas@udl.cat
Iolanda Nicolau-Lapeña. Doctora en Ciencia y Tecnología Agraria y Alimentaria. Investigadora postdoctoral del Departamento de Tecnología de Alimentos. Universitat de Lleida. 973702314 iolanda.nicolau@udl.cat
Inmaculada Viñas. Catedrática. Responsable del Grupo de Postcosecha del Departamento de Tecnología de Alimentos. Universitat de Lleida. 973702677 inmaculada. vinas@udl.cat
Isabel Alegre. Doctora en Ciencia y Tecnología Agraria y Alimentaria. Profesora del Departamento de Tecnología de Alimentos. Universitat de Lleida. 973702817 isabel. alegre@udl.cat}

RESUMEN

Debido a la prevalencia de Listeria monocytogenes en productos cárnicos cocidos y a su capacidad de desarrollarse en este tipo de producto y con el objetivo de cumplir con los criterios de seguridad alimentaria (Reglamento 2073/2005), que establecen un límite para este patógeno en 100 ufc/g en los cárnicos cocidos al final de su vida útil, se ha evaluado la efectividad de distintos agentes bioconservantes comerciales (varios cultivos antagonistas, una bacteriocina y un bacteriófago) para controlar este patógeno en fiambre loncheado. Se estudió la aplicación de estas técnicas después de la etapa de loncheado, etapa crítica del proceso ya que tiene lugar una manipulación del producto ya tratado térmicamente y que no recibirá un nuevo tratamiento que permita el control del patógeno. En las condiciones ensayadas, los resultados mostraron la eficacia del bacteriófago P100 (PhageGuard Listex^TM) aplicado al 0,5 % en el fiambre loncheado y envasado en atmósfera modificada (70 % N₂ y 30 % CO₂) para controlar el patógeno, reduciendo la población de L. innocua a niveles de no detectarlo en 25 g de fiambre cuando se conservó a 4°C durante 14 días. Por lo tanto, la aplicación de la bioconservación se presenta como una herramienta útil para garantizar la seguridad alimentaria en productos cárnicos cocidos loncheados.

Palabras clave: fiambre, Listeria, loncheado, bacteriófago, bacteria acido láctica, vida útil.

INTRODUCCIÓN

Durante la elaboración de un fiambre loncheado envasado en atmósfera modificada este se somete a distintas etapas industriales que aseguran su calidad e inocuidad. La cocción o tratamiento de pasteurización (70°C 55 min) de la pieza es una etapa clave del proceso, ya que es la única dirigida a reducir la presencia de microorganismos patógenos en el producto. Tras el tratamiento térmico, el fiambre se enfría, desmolda y lonchea en salas blancas, las cuales ofrecen una zona aséptica de corte-envasado libre de contaminantes biológicos. Sin embargo, el fiambre cocido, en formato de piezas de unos 5-7 kg, también se distribuye al comercio minorista para ser loncheado y distribuido al detalle, ya sea en papel o reenvasado (en envases termoformados con autocierre, etc.). En estas circunstancias, el proceso de loncheado y envasado del producto no se realiza en condiciones asépticas, por lo tanto, el área de trabajo, el estado de las superficies, utensilios y envases utilizados, junto a la formación de los manipuladores pueden llegar a incrementar el riesgo biológico asociado a Listeria monocytogenes en los cárnicos cocidos. L. monocytogenes es una bacteria patógena que se ha aislado de multitud de plantas de procesado de alimentos[1] y que tiene la habilidad de crecer a temperaturas de refrigeración, elevada concentración de sal y prácticamente en cualquier tipo de atmosfera modificada, ya que sería necesario un 100% de CO₂ para inhibirla[2, 3]. Aunque la incidencia de la toxinfección que provoca (listeriosis invasiva) es baja, presenta la tasa de mortalidad más elevada (13 %) de las toxiinfecciones registradas en la Unión Europea[4].

Ante el hecho de que los productos comercializados al detalle no indican fecha de caducidad ni consumo preferente, el Comité Científico Asesor de Seguridad Alimentaria de Cataluña llevó a cabo recientemente un estudio que mostró una prevalencia de L. monocytogenes del 10% en las muestras de jamón cocido analizadas en el estudio (n=20). Asimismo, se determinó que las características de pH (5,97 ± 0,44) y actividad de agua (0,973 ± 0,004) de este producto favorecen el crecimiento del patógeno por lo que se estableció la vida segura de este tipo de alimento por debajo de los 5 días[5]. Por lo tanto, es necesario establecer un plan de control que garantice la seguridad de los fiambres loncheados en condiciones no asépticas. Ante todo, debe primar evitar la contaminación cruzada, controlando tanto las fuentes y vías de la contaminación de este patógeno, como asegurando la aplicación de planes de limpieza y desinfección adecuados y buenas prácticas de manipulación. Sin embargo, se hace necesario aplicar medidas de control adicionales para reducir la presencia de L. monocytogenes en los alimentos listos para el consumo que no reciben ningún tratamiento térmico antes de consumirse.

La bioconservación, que es un método de conservación que incrementa la seguridad de los alimentos mediante el uso de microorganismos y sus metabolitos sin modificar las propiedades organolépticas del producto, puede ser una herramienta adicional para asegurar la inocuidad de los fiambres loncheados. Dentro de esta tecnología puede aplicarse directamente un cultivo antagonista sobre el alimento, aplicar las sustancias antimicrobianas producidas por este como las bacteriocinas y/o aplicar un bacteriófago.

Estos últimos son virus que tienen como única diana de acción las bacterias. Con el objetivo de evaluar la eficacia de distintas soluciones comerciales de bioconservación para reducir el riesgo microbiológico asociado a L. monocytogenes en fiambre loncheado se aplicaron siete técnicas de bioconservación distintas. Las técnicas estudiadas incluyeron un bacteriófago (PhageGuard Listex^TM), distintos cultivos antagonistas (SafePro^® B-LC-20, SafePro^® B-LC-48, SafePro^® B-SF- 43 y Pseudomonas graminis CPA-7), una bacteriocina (NisinZ^®) y un cultivo bacteriano (Lactobacillus rhamnosus GG) que a elevada concentración ha mostrado efecto probiótico.

MÉTODOS

Fiambre y agentes bioconservantes empleados

Para la experimentación se utilizó un fiambre de carne comercial (ingredientes: carne de cerdo (55%), agua, fécula de patata, sal, proteína de soja, azúcar, dextrosa de maíz, aroma de humo y aromas. Estabilizadores: E-420, E-450 y E-407. Conservadores: E-250. Antioxidantes: E-315. Colorante natural: E-120; sabor ahumado) de pequeño formato (500 g). Inicialmente se determinó la efectividad de siete técnicas distintas de bioconservación para controlar Listeria monocytogenes en el fiambre. La Tabla 1 muestra las técnicas seleccionadas, junto a la marca comercial, formato de comercialización y concentración aplicada. En la experimentación se utilizó Listeria innocua como subrogado de L. monocytogenes, ya que el primero presenta el mismo comportamiento que la especie patógena.

Determinación de la efectividad de siete agentes bioconservantes

Para simular la contaminación durante el loncheado, se inocularon superficialmente porciones de 1 g de producto con un cóctel de cuatro cepas de L. innocua (L. innocua CECT910, L. innocua CECT 8848, L. innocua CECT 4030 y L. innocua Tecal 1.17), usando la técnica de la gota, para obtener una población inicial de 100 ufc/g de fiambre. Las porciones inoculadas de dividieron en 8 lotes. Uno de los lotes se utilizó como control de L. innocua y no recibió ningún tratamiento de bioconservación, el resto se trataron con las distintas técnicas de bioconservación a evaluar (a la concentración recomendada por el fabricante y/o las autoridades, tabla 1). Una vez tratadas las muestras, estas se almacenaron a 13°C en condiciones aerobias durante 6 días (condiciones seleccionadas como ensayo de desafío), y se determinó la población de L. innocua al final de la conservación mediante la siembra en el medio selectivo Palcam agar (Biokar). Las placas se incubaron a 37°C durante 48 horas y pasado este tiempo se realizó el recuento de las colonias con aspecto típico.

Establecimiento de la dosis óptima de aplicación

Con el objetivo de ajustar la dosis de tratamiento óptima para las tres técnicas que mostraron una inhibición igual o superior a 3 unidades logarítmicas frente a L. innocua en el primer ensayo, se llevó a cabo un nuevo ensayo de desafío en que se aplicaron diferentes concentraciones de PhageGuard Listex^TM (1%, 0,5% y 0,2%), SafePro^® B-SF-43 (25 g/100 kg y 25 g/1000 kg) y L. rhamnosus GG (10⁸ y 10⁶ ufc/g). Las muestras se conservaron en las mismas condiciones ensayadas anteriormente (aerobiosis y 13°C), y se determinó la población de L. innocua a los 3 y 6 días de conservación.

Ensayo semi-comercial

Finalmente, se seleccionaron los tratamientos que mostraron mayor eficacia en el segundo ensayo de desafío y se realizó un ensayo en condiciones semi- comerciales utilizando el mismo tipo de fiambre que se cortó en lonchas de 3 mm de grosor y 6 cm de diámetro (peso medio por loncha de 15,0 ± 6,8 g). Todas las lonchas se expusieron dentro de una cabina de flujo laminar (simulando la sala blanca) y se inocularon artificialmente mediante pulverización con una suspensión del cóctel de L. innocua para obtener una población inicial de 100 ufc/g de fiambre. Transcurridos 10 minutos de la inoculación, las muestras se dividieron en cuatro lotes, uno de ellos, el control de L. innocua, no recibió ningún tratamiento. Sobre el resto de lonchas inoculadas con L. innocua se pulverizaron separadamente las tres soluciones de bioconservación a evaluar: PhageGuard Listex^TM 0,2%, PhageGuard Listex^TM 0,5% y SafePro^® B-SF-43 (25 g/100 kg).

Seguidamente, para cada tratamiento se distribuyeron 6 lonchas del fiambre (peso medio 89,9 ± 6,8 g/ bandeja, Fotografía 1) en bandejas de polipropileno (PP transparentes, Tecnofood TF013) y se sellaron con un film plástico termosellable (P12-2050PXNP (Tecnopack) con una permeabilidad al O2: 110 mL/ m2·24h·bar (medido a 23°C y 0% HR) y permeabilidad al vapor de agua: 10 g/m2·24h·bar (medido a 38°C y 90% HR)) incorporando una atmósfera comercial (ALIGAL 13, Air Liquid) enriquecida en nitrógeno (70%) y dióxido de carbono (30%). Todas las muestras se almacenaron a 4 °C durante 14 días y se evaluó la concentración de L. innocua y de los agentes bioconservantes a los 7 y 14 días. Cada día de análisis se tomaron 3 bandejas de cada tratamiento y antes de la apertura del envase se determinó la concentración de oxígeno y dióxido de carbono en el espacio de cabeza utilizando un analizador de gas O₂/ CO₂ (CheckPoint, PBI Dansensor). Seguidamente, de cada bandeja se tomaron 25 g de muestra y se homogenizaron con agua de peptona tamponada, muestra a partir de la cual se determinó la población de L. innocua (placas medio Palcam agar) y de los agentes bioconservantes (placas De Man Rogosa and Sharpe agar (MRS, Biokar) para la bacteria ácido láctica y método de superposición de agar semisólido, siguiendo las instrucciones del proveedor del producto, para el recuento del bacteriófago.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuando se evaluaron las siete técnicas de bioconservación a 13°C (Figura 1), únicamente tres de los siete tratamientos redujeron la población de L. innocua en el fiambre de forma significativa. Mientras que en la muestra que no recibió ningún tratamiento de bioconservación la población de L. innocua alcanzó una concentración de 9,0 ± 0,2 log ufc/g (incremento de 6,8 ± 0,4 unidades logarítmicas en 6 días a 13°C), los tratamientos con L. rhamnosus GG (108 ufc/g), SafePro® B-SF-43 (25 g/100 kg) y PhageGuard Listex^TM (1%) redujeron la población de L. innocua en 5,4 ± 0,3, 4,6 ± 0,7 y 2,9 ± 0,8 unidades logarítmicas, respectivamente. Aunque P. graminis CPA-7 había mostrado actividad antagonista frente a L. monocytogenes en manzana[6], melocotón[7], pera[8] y melón mínimamente procesados[9], no fue efectivo en esta matriz. Por lo tanto, tras este primer estudio se descartaron P. graminis CPA-7, NizinZ^® y los formulados de cultivos antagonistas, SafePro^® B-LC-20 y SafePro^® B-LC-48.

Al reducir la dosis de aplicación de las técnicas que habían mostrado mayor efectividad para el control de L. innocua se observó que PhageGuard Listex^TM, independientemente de la dosis aplicada, redujo significativamente la población de L. innocua tras 3 días de conservación hasta niveles de 2,7 ± 1,3, 1,9 ± 0,0 y 2,1 ± 0,2 log ufc/g en el fiambre para las dosis de 0,2%, 0,5% y 1%, respectivamente (Figura 2). Se observó la misma efectividad frente a L. innocua con los tratamientos SafePro^® B-SF-43 (25 g/100 kg) y L. rhamnosus GG (10⁸ ufc/g), presentando poblaciones de 2,1 ± 0,2 y 3,1 ± 0,3 log ufc/g a los 3 días, respectivamente. Cuando se evaluó la efectividad de las técnicas al final del tiempo de conservación, la población de L. innocua no incrementó significativamente de los 3 a los 6 días con los tratamientos con PhageGuard Listex^TM y SafePro^® B-SF-43, a todas las concentraciones ensayadas. Sin embargo, en la muestra tratada con L. rhamnosus GG (10⁸ ufc/g) la población de L. innocua incrementó en 1,9 ± 0,2 unidades logarítmicas en el fiambre. Por lo tanto, debido a la efectividad los agentes PhageGuard Listex^TM y SafePro^® B-SF-43, estos se seleccionaron para evaluarse bajo condiciones semi-comerciales en el fiambre inoculado artificialmente con L. innocua.

Alcanzados los 7 días de conservación del ensayo semi-comercial (atmosfera modificada activa (70% N2 y 30% CO2) y refrigeración (4 °C)) se observó una reducción de la población de L. innocua en el fiambre hasta no detectarla en 25 g (analizando 3 bandejas por tratamiento), en los tres tratamientos evaluados: PhageGuard Listex^TM (0,2%), PhageGuard Listex^TM (0,5%) y SafePro^® B-SF-43 (25 g/100 kg) (Figura 3). Cabe destacar que el tratamiento PhageGuard Listex^TM aplicado al 0,5% permitió controlar L. innocua justo después de la aplicación de la técnica de bioconservación, mientras que la dosis menor del mismo tratamiento (0,2%) y el tratamiento con SafePro^® B-SF-43 precisó de 7 días para reducir la población de L. innocua por debajo del límite de detección. La misma efectividad se observó a los 14 días de conservación con todos los tratamientos excepto con el tratamiento con SafePro® B-SF-43 donde se detectó L. innocua en el fiambre en una de las 3 bandejas analizadas, con una población de L. innocua de 0,3 ± 0,1 log ufc/g.

Con el objetivo de elucidar las diferencias en modo de acción de los agentes que mostraron mayor efectividad en las condiciones ensayadas también se determinó la concentración de los agentes a lo largo de la conservación del fiambre en el ensayo semi-comercial (Figura 4). Mientras que el bacteriófago P100 (contenido en el agente PhageGuard Listex^TM) mantuvo una población estable a lo largo de la conservación, entre 7,5-8,0 log partículas formadoras de unidad (pfu)/g en la dosis 0,2% y de 7,6-8,4 log pfu/g en la dosis más concentrada (0,5%), la población de Leuconostoc carnosum (bacteria ácido láctica contenida en el agente SafePro^® B-SF-43) incrementó a lo largo del tiempo de conservación pasando de 5,7 ± 0,1 log ufc/g en el momento de la inoculación a 8,9 ± 0,1 log ufc/g al final de la conservación. Los datos de la concentración de gases en el envase (Figura 5) mostraron que en las bandejas del fiambre tratado con la bacteria ácido láctica la concentración de dióxido de carbono incrementó con el tiempo, alcanzando valores de 36,6 ± 1,5% de CO₂, mientras que las muestras tratadas con el bacteriófago mantuvieron la concentración inicial de gases inyectada. La diferencia observada entre los agentes de bioconservación evaluados se debe a la naturaleza biológica del agente aplicado.

PhageGuard Listex^TM contiene un bacteriófago que tiene como diana de acción a Listeria (bacteria Gram positiva), penetrando en el interior de esta y produciendo una posterior lisis de la célula bacteriana[10], mientras que el agente SafePro^® B-SF-43 contiene una bacteria ácido láctica cuyo efecto bacteriostático se atribuye a la competencia por nutrientes y la producción de ácidos orgánicos débiles[11]. Aunque esta última tiene un mayor espectro de acción, no únicamente frente a Listeria, limitación que si presenta el bacteriófago P100, es necesario que la bacteria ácido láctica se desarrolle y produzca ácidos orgánicos débiles en el alimento para ejercer su efecto antimicrobiano, precisando más tiempo para controlar L. innocua que el virus bacteriano. Esto se corrobora con lo observado en la evolución de la población de les agentes de bioconservación estudiados (Figura 4), donde la población de L. carnosus incrementó a lo largo del tiempo de conservación. También es importante destacar que, aunque esta última sea una bacteria mesófila, tuvo la capacidad de multiplicarse a temperaturas de refrigeración y ejercer su acción antimicrobiana en fiambre. Sin embargo, el hecho que esta última modificara la mezcla de gases del envase al incrementar el tiempo de conservación podría llegar a ocasionar modificaciones en las características organolépticas del producto, mientras que en las muestras tratadas con el bacteriófago la concentración de gases del envase no se vieron modificadas.

CONCLUSIONES

Debido a la omnipresencia de Listeria, su habilidad para formar biopelículas en superficies dificultando su eliminación y el riesgo real observado en los productos cárnicos cocidos loncheados, el agente de bioconservación PhageGuard Listex^TM (Micreos Food Safety B.V., Holanda) evaluado en este estudio se presenta como una herramienta útil para incrementar la seguridad alimentaria en el fiambre loncheado.

Sin embargo, en el proceso de selección de una herramienta de bioconservación es imprescindible que esta técnica se evalúe en el producto en que se aplicará (manteniendo la composición del alimento, la concentración de ingredientes e incluso el proveedor de estos), ya que las condiciones intrínsecas del producto como el pH o la actividad de agua pueden modificar la efectividad de los agentes o la habilidad del patógeno de sobrevivir. Del mismo modo, las condiciones de fabricación, conservación y distribución del alimento acabado también deben tenerse en cuenta en el momento de la selección.

En conclusión, la aplicación de la bioconservación se presenta como una herramienta adicional para asegurar el cumplimiento de los criterios de seguridad alimentaria establecidos por la legislación durante la vida útil en los productos cárnicos cocidos loncheados (Reglamento 2073/2005). Si bien se debe tener en cuenta que siempre hay que aplicar unas buenas prácticas de fabricación y cumplir con los planes de prerrequisitos establecidos.

AGRADECIMIENTOS

Actividad financiada a través de la Operación 01.02.01 de Transferencia Tecnológica del Programa de desarrollo rural de Cataluña 2014- 2022.

Figura 1. Población de Listeria innocua en el fiambre inoculado artificialmente con un cóctel de cuatro cepas de L. innocua, conservado 6 días a 13 °C después de la aplicación de siete técnicas de bioconservación distintas (PhageGuard ListexTM, NisinZ®, SafePro® B-LC-20, SafePro® B-LC-48, SafePro® B-SF-43, L. rhamnosus GG y P. graminis CPA-7). Distintas letras representan diferencias significativas entre tratamientos aplicando la prueba de Tukey.

Figura 2. Población de Listeria innocua en el fiambre inoculado artificialmente con un cóctel de cuatro cepas, conservado 6 días a 13 °C después de la aplicación de las tres mejores técnicas de bioconservación a distintas dosis. El asterisco muestra diferencias significativas frente al control a tiempo cero aplicando la prueba de Dunnett.

Figura 3. Población de Listeria innocua en el fiambre inoculado artificialmente con un cóctel de cuatro cepas y tratado con dos agentes bioconservantes (PhageGuard Listex^TM y SafePro^® B-SF-43), envasado en atmosfera modificada (70 % N₂ y 30 % CO₂) y conservado a 4 °C durante 14 días. El asterisco muestra diferencias significativas frente al control a tiempo cero aplicando la prueba de Dunnett. Límite de detección de 0,3 log ufc/g fiambre.

Figura 4. Población de los agentes bioconservantes (PhageGuard Listex^TM (bacteriófago P100) y SafePro^® B-SF-43 (Leuconostoc carnosum) a lo largo de la conservación del fiambre en condiciones semi-comerciales (atmosfera modificada (70 % N₂ y 30 % CO₂) y conservado a 4 °C durante 14 días).

Figura 5. Concentración de gases del espacio de cabeza del envase de cárnico cocido tratado con los agentes bioconservantes (PhageGuard Listex^TM y SafePro^® B-SF-43 a lo largo de la conservación del fiambre en condiciones semi-comerciales (atmosfera modificada (70 % N₂ y 30 % CO₂) y conservado a 4 °C durante 14 días).

Referencias bibliográficas
[1] A. Townsend, L. K. Strawn, B. J. Chapman, y L. L. Dunn, “A systematic review of listeria species and Listeria monocytogenes prevalence, persistence, and diversity throughout the fresh produce supply chain,” Foods, vol. 10, no. 6, 2021, doi: 10.3390/foods10061427.
[2] M. Fao and A. Alimentaris, “Acsa Brief,” pp. 2011–2012, 2018.
[3] S. Bover y M. Garriga, “Condiciones que determinan el crecimiento y la supervivencia de Listeria monocytogenes en alimentos listos para el consumo.,” Inst. Recer. i Tecnol. Agroaliment. General. Catalunya, 2014.
[4] E. Food y S. Authority, “The European Union One Health 2019 Zoonoses Report,” EFSA J., vol. 19, no. 2, 2021, doi: 10.2903/j.efsa.2021.6406.
[5] C. Científic y A. De Seguretat, “Informe sobre l ’establiment de la vida útil segura de determinats aliments a punt per al consum , llescats i preenvasats en el comerç minorista en relació amb el risc de Listeria monocytogenes,” 2022.
[6] I. Alegre, I. Viñas, J. Usall, M. Anguera, R. Altisent, y M. Abadias, “Antagonistic effect of Pseudomonas graminis CPA-7 against foodborne pathogens in fresh-cut apples under simulated commercial conditions,” Food Microbiol., vol. 33, no. 2, pp. 139–148, 2013, doi: 10.1016/j.fm.2012.09.007.
[7] I. Alegre, I. Viñas, J. Usall, N. Teixidó, M. J. Figge, y M. Abadias, “Control of foodborne pathogens on fresh-cut fruit by a novel strain of Pseudomonas graminis,” Food Microbiol., vol. 34, no. 2, pp. 390–399, 2013, doi: 10.1016/j.fm.2013.01.013.
[8] M. B. Iglesias, M. L. López, G. Echeverría, I. Viñas, L. Zudaire, y M. Abadias, “Evaluation of biocontrol capacity of Pseudomonas graminis CPA-7 against foodborne pathogens on fresh-cut pear and its effect on fruit volatile compounds,” Food Microbiol., vol. 76, pp. 226–236, 2018, doi: 10.1016/j.fm.2018.04.007.
[9] C. Collazo et al., “Effect of Pseudomonas graminis strain CPA-7 on the ability of Listeria monocytogenes and Salmonella enterica subsp. enterica to colonize Caco-2 cells after pre-incubation on fresh-cut pear,” Int. J. Food Microbiol., vol. 262, 2017, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2017.09.003.
[10] D. G. Fernández, L. F. Llamas, A. R. González, y P. G. Suárez, “Bacteriophages and endolysins in the food industry,” Arbor, vol. 196, no. 795, pp. 1–11, 2020, doi: 10.3989/arbor.2020.795n1008.
[11] M. Baka, E. Noriega, L. Mertens, E. Van Derlinden, y J. F. M. Van Impe, “Protective role of indigenous Leuconostoc carnosum against Listeria monocytogenes on vacuum packed Frankfurter sausages at suboptimal temperatures,” Food Res. Int., vol. 66, pp. 197–206, 2014, doi: 10.1016/j.foodres.2014.08.011.