<sub>Paula Fernández-Gómez, Márcia Oliveira, Montserrat González-Raurich, Avelino Álvarez-Ordóñez y Mercedes López*
Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos. Universidad de León. España.
* Correspondencia: Mercedes López. Teléfono: + 34987291183. E-mail: mmlopf@unileon.es</sub>

RESUMEN

El plasma atmosférico no térmico es una tecnología con numerosas y diversas aplicaciones en estrategias para el control de biofilms microbianos en la industria alimentaria. En este artículo se describe tanto su uso directo para la inactivación de biofilms, incluyendo el agua activada por plasma como solución desinfectante alternativa a los biocidas tradicionales, como su utilización para el desarrollo de recubrimientos anti- biofilm sobre superficies industriales.

BIOFILMS MICROBIANOS

Los biofilms son comunidades de microorganismos complejas que crecen adheridas a superficies y englobadas en una matriz polimérica extracelular, que protege al conjunto bacteriano de agentes externos que podrían limitar su supervivencia, como condiciones ambientales adversas e, incluso, agentes antimicrobianos.

A pesar de que la composición de los biofilms varía ampliamente, su componente principal es el agua, llegando a representar hasta el 97 % del peso total, siendo el resto de los constituyentes el ADN, proteínas y biopolímeros de polisacáridos, además de las propias bacterias. Esta matriz confiere a los microorganismos que crecen en estas estructuras una serie de ventajas que favorecen su crecimiento, como la capacidad para alterar el microambiente, facilitando la transferencia de material genético entre las células, reduciendo la deshidratación, incrementando la disponibilidad de nutrientes y mejorando la eliminación de sustancias potencialmente tóxicas.

De particular relevancia resulta el hecho de que las células microbianas dentro de un biofilm son significativamente más resistentes a diferentes tipos de intervenciones antimicrobianas, dirigidas a controlar su aparición, y que las biopelículas pueden actuar como un reservorio de microorganismos persistentes (Nadell et al., 2016).

La formación de un biofilm bacteriano, que puede generarse sobre una amplia variedad de superficies, desde inertes hasta tejidos vivos, incluyendo los alimentos, está regulada por un proceso de autoinducción o quorum sensing. Este mecanismo de regulación y comunicación celular está basado en la capacidad que posee una bacteria para detectar la densidad celular en un medio, coordinando su comportamiento, no sólo a nivel individual sino también a nivel de grupo, a través de la presencia de una molécula señal o autoinductor presente en el medio. A medida que las bacterias se adhieren a la superficie, estas señales químicas aumentan informando a las bacterias cercanas de su localización. Este mecanismo resulta imprescindible durante la maduración del biofilm y la posterior dispersión celular.

Figura 1: Fases en la formación de un biofilm.

La formación del biofilm (Figura 1) consta de cinco etapas:

1. En la primera, tiene lugar la unión reversible de las bacterias a la superficie.

2. A continuación, la adherencia se vuelve irreversible debido a que las bacterias son capaces de producir polímeros y adhesinas, responsables de asegurar la unión bacteria- superficie.

3. Posteriormente, la bacteria comienza a dividirse creando uniones entre las propias células, así como con la superficie, desarrollándose una microcolonia.

4. Es a partir de la formación de esta colonia cuando se considera que se inicia la maduración del biofilm, ya que es en esta etapa cuando las bacterias son capaces de secretar exopolisacáridos, teniendo lugar el desarrollo de la matriz, con la formación de estructuras características, como los canales o poros, responsables del intercambio de nutrientes y la eliminación de deshechos bacterianos. La composición del exopolisacárido varía en función de la especie bacteriana, aunque también se ha demostrado que, dentro de una misma especie, ésta puede variar dependiendo de las condiciones ambientales en las que se desarrolle el biofilm.

5. Por último, cuando la densidad microbiana en la matriz es elevada, algunas células se liberan de la misma para colonizar otras superficies, cerrando así el proceso de desarrollo del biofilm.

LIMITACIONES DE LAS ESTRATEGIAS TRADICIONALES PARA EL CONTROL DE BIOFILMS

En la industria alimentaria, las superficies y los equipos se encuentran frecuentemente colonizados por microorganismos en forma de biofims, lo que resulta especialmente preocupante, ya que los biofilms formados por microorganismos, tanto alterantes como patógenos, pueden servir como fuente de contaminación cruzada de los alimentos, reduciendo así la efectividad de las estrategias de conservación de alimentos y comprometiendo, en consecuencia, su calidad y seguridad (Coughlan et al., 2016).

Por ello, las industrias alimentarias basan sus protocolos de limpieza y desinfección en el uso de agentes biocidas que permitan establecer barreras a la entrada de microorganismos no deseados, controlando la colonización de superficies y equipos en contacto con alimentos. Los biocidas se emplean, generalmente, a concentraciones superiores a las mínimas inhibitorias para todos los microorganismos diana principales y, por lo tanto, deberían poder garantizar su inactivación, evitando así la supervivencia de microorganismos peligrosos. Sin embargo, es bien sabido que los biocidas y otros antimicrobianos son menos efectivos en la inactivación de células en estado sésil (formando biofilms) que en estado planctónico. De hecho, varias publicaciones, que evalúan la tolerancia de las principales bacterias patógenas transmitidas por los alimentos a una amplia gama de desinfectantes de uso industrial o sus compuestos activos a las concentraciones de uso industrial, han demostrado que estos no son capaces de inactivar completamente los microorganismos diana cuando se encuentran formando biofilms (Chaitiemwong et al., 2014; Chylkova et al., 2017; Fagerlund et al., 2016; Martin et al., 2016). Además, en varios estudios se ha descrito que la tolerancia a diferentes biocidas es mayor en los biofilms mixtos o multi-especie que en los formados por una única especie (Bridier et al., 2015; Giaouris et al., 2013; Wang et al., 2013).

También es importante tener en cuenta que los microorganismos que colonizan las plantas de procesado de alimentos se ven frecuentemente expuestos a concentraciones subinhibitorias de biocidas en nichos particulares (por ejemplo, en grietas y otros lugares de difícil acceso) o como consecuencia de su uso inadecuado, como, por ejemplo, debido a una formulación errónea, almacenamiento inadecuado o aplicación en superficies húmedas, con la consiguiente dilución del compuesto a concentraciones que pueden ser subletales. Además, es importante destacar que varios autores han observado que la adaptación previa a algunos biocidas y compuestos activos, como el nitrito de sodio y el hipoclorito de sodio en Escherichia coli, el cloruro de benzalconio en Listeria monocytogenes, el hipoclorito de sodio en Staphylococcus aureus y Salmonella Typhimurium, el etanol y la cloramina T en S. aureus, y el fosfato trisódico, ácido acético, hipoclorito de sodio y dos desinfectantes comerciales en Campylobacter jejuni, puede favorecer la formación de biofilms (Buzón-Durán et al., 2017; Capita et al., 2017; Ortiz et al., 2014; Slany et al., 2017; Techaruvichit et al., 2016).

Por ello, se ha dedicado un gran esfuerzo investigador a la mejora de los métodos y estrategias disponibles para eliminar estas complejas estructuras de los ambientes industriales o al desarrollo de nuevas herramientas de inhibición o de eliminación que resulten más efectivas, económicas y sostenibles (Figura 2).

Figura 2: Principales estrategias para el control de biofilms formados por microorganismos no deseados en ambientes de procesado de alimentos. Adaptada de Alvarez-Ordóñez et al. (2019).

PLASMA ATMOSFÉRICO NO TÉRMICO

El plasma atmosférico no térmico (PANT) ha recibido, en estos últimos años, una gran atención tanto en su aplicación directa, gracias a que presenta una alta capacidad desinfectante frente a biofilms de un amplio espectro de microorganismos (Puligundla & Mok, 2017), como en su aplicación indirecta para la deposición de recubrimientos anti-biofilm sobre superficies industriales (Sainz-García et al., 2017).

El plasma es un gas ionizado, que se alcanza cuando al gas se le aporta suficiente energía, generalmente mediante la aplicación de una descarga eléctrica, lo que provoca fenómenos de ionización, disociación y excitación de sus átomos y moléculas.

Consecuentemente, los plasmas están constituidos, básicamente, además de por iones, tanto positivos como negativos, y electrones, por radicales libres, átomos y moléculas, en estado fundamental y de excitación, y radiaciones electromagnéticas de un amplio espectro, incluidas en el rango ultravioleta (López et al., 2021). Ahora bien, en función del estado de equilibrio termodinámico entre los electrones y las especies pesadas (átomos, moléculas, iones, radicales libres) que los componen, los plasmas se clasifican en térmicos y no térmicos. En los plasmas térmicos, la temperatura de los electrones libres y la de las especies pesadas es la misma, pudiéndose alcanzar temperaturas muy altas, hasta de varias decenas de miles de grados centígrados. Por el contrario, en los plasmas no térmicos, a pesar de que la energía de los electrones es mucho mayor a la que presentan las especies pesadas, muestran, en su conjunto, temperaturas próximas a la ambiental y, por tanto, resultan adecuados para el tratamiento de materiales sensibles al calor. Además, los recientes avances tecnológicos en las fuentes de generación de plasma han permitido desarrollar equipos capaces de generar plasma a presión atmosférica, simplificando enormemente el equipo (al evitar la necesidad de cámaras de vacío), abaratando tanto los costes de producción de plasma como los costes de mantenimiento. Estas características dotan a la tecnología de plasma atmosférico frío de una gran versatilidad, relativa simplicidad y bajo coste.

Figura 3: Difusión en el agua de especies químicas reactivas del plasma y formación de nuevas especies, generando agua activada por plasma (PAW). Aumento de la conductividad eléctrica y del potencial de óxido-reducción y descenso de pH. Adaptada de López et al. (2021).

APLICACIÓN DIRECTA DE PLASMA ATMOSFÉRICO NO TÉRMICO

Existen diversos estudios en los que se ha demostrado la efectividad del PANT en la eliminación de biofilms formados por Salmonella en vidrio (Niemira et al., 2014), E. coli, L. monocytogenes y S. aureus en tereftalato de polietileno (Ziuzina et al., 2015) y Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas libanensis, Enterobacter cloacae, Kocuria carniphila, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis en acero inoxidable (Mai- Prochnow et al., 2016).

Sin embargo, se ha señalado que la aplicación de esta tecnología en la práctica industrial presenta algunas limitaciones relacionadas, fundamentalmente, con la necesidad de generación in situ.

Por ello, en los últimos años se ha prestado una mayor atención a la aplicación del PANT de forma indirecta, mediante la obtención previa de agua activada por plasma (PAW, Plasma-Activated Water), el producto resultante de la reacción del PANT con agua, que exhibe propiedades antimicrobianas, adquiridas por la capacidad que presentan las especies químicas presentes en el PANT de difundir y de interaccionar entre sí o con el agua, dando lugar a la formación de nuevos compuestos citotóxicos (Figura 3). De hecho, la presencia de especies reactivas del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS), incluyendo radicales hidroxilo, oxígeno singlete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno, así como óxido nítrico y sus derivados formados con agua, tales como nitratos, nitritos y peroxinitritos, se ha puesto de manifiesto en diversos estudios (Choi et al., 2019; Khan & Kim, 2019; Xiang et al., 2019; Zhao et al., 2019). Además, el tratamiento de agua por PANT induce un aumento en su conductividad eléctrica y potencial de óxido- reducción y una reducción en su valor de pH, hasta valores próximos a 3 (Oliveira et al., 2022).

Es de destacar que el PAW proporciona una serie de ventajas adicionales frente al tratamiento directo con PANT, como son la facilidad de generación y aplicación, así como su capacidad para ser almacenada, lo que ha conducido a que diversos grupos de investigación estén explorando su potencial como estrategia antibiofilm, habiéndose obtenido resultados muy prometedores para diversos microorganismos adheridos a distintos materiales ampliamente utilizados en la industria alimentaria, incluyendo acero inoxidable, polietileno de alta densidad y poliestireno (Durek et al., 2023; Fernández- Gómez et al., 2022; Kamgang-Youbi et al., 2009; Smet et al., 2019; Tan & Karwe, 2021; Xu & Tan, 2023). Por ejemplo, Kamgang-Youbi et al. (2009) observaron que los recuentos de Saccharomyces cerevisiae, Hafnia alvei, Leuconostoc mesenteroides y Staphylococcus epidermidis adheridas al acero inoxidable disminuyeron en 3,1, 5,4, 4,7 y 6,1 unidades logarítmicas, respectivamente, tras su exposición al PAW durante 30 minutos. Es de destacar que el tratamiento no provocó problemas de corrosión en el acero. Por su parte, Smet et al. (2019) encontraron que el número de células de L. monocytogenes y S. Typhimurium adheridas al poliestireno se redujo hasta en 3,9 unidades logarítmicas tras 30 minutos de exposición al PAW.

En un estudio llevado a cabo por nuestro grupo de investigación (Fernández-Gómez et al., 2022) en el que se evaluó la influencia ejercida por el tiempo de exposición sobre la efectividad del PAW para inactivar las células de un cóctel de tres cepas de L. monocytogenes adheridas a acero inoxidable y poliestireno (106 - 107 ufc/cm²), se pudo comprobar que tiempos de tratamiento de 30 y 60 minutos, respectivamente, reducían los recuentos a valores inferiores a 102 ufc/cm² (Figura 4). Por su parte, Tan & Karwe (2021) y Xu & Tan (2023) han descrito que la circulación de PAW, durante 15 y 5 minutos, respectivamente, por un sistema de tuberías a una velocidad de 1 m/s, presentaba una eficacia letal similar a la obtenida con una solución de hipoclorito, 100 ppm, frente a los biofilms de Enterobacter aerogenes y Klebsiella michiganensis, consiguiendo reducir las poblaciones celulares entre 2,5 y 3,5 unidades logarítmicas.

DEPOSICIÓN DE RECUBRIMIENTOS MEDIANTE PLASMA ATMOSFÉRICO NO TÉRMICO

La modificación de los materiales utilizados en la industria alimentaria se ha revelado como una estrategia muy prometedora para prevenir la formación de biofilms. Dado que la formación de esta estructura implica, como primer paso, la unión o adhesión de células planctónicas a una superficie, si ésta se modifica en cierta medida, por ejemplo, alterando su morfología o propiedades físico-químicas (hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga eléctrica, etc.), la adhesión microbiana y, en consecuencia, el crecimiento y la maduración del biofilm pueden ser controlados (Fernández-Gómez et al., 2022; Muro-Fraguas et al., 2020). A diferencia de las técnicas de deposición convencionales (deposición química húmeda, plasma a alta/baja presión, etc.), la técnica de deposición mediante plasma-polimerización a baja temperatura presenta una serie de ventajas. Por una parte, esta técnica permite una deposición seca, en la que se aplica un recubrimiento en una única etapa para conferir propiedades funcionales a la superficie diana.

Además, se trata de una tecnología respetuosa con el medio ambiente, ya que no se generan productos químicos residuales, resultando, asimismo, económica, por el relativamente bajo gasto de consumibles requeridos, al aplicarse recubrimientos de espesores a escala nano o micro. Debido a que el proceso de deposición se realiza a presión atmosférica y a temperaturas inferiores a 100^oC, se evitan alteraciones no deseadas en las propiedades del sustrato. Finalmente, se puede llevar a cabo un control de las características de los recubrimientos obtenidos modificando el tipo de precursor utilizado y/o los parámetros del proceso (flujo de gas, potencia suministrada, etc.), lo que permite que se pueda mejorar la superficie del sustrato de manera específica manteniendo el resto de propiedades sin alterar (Sainz-García et al., 2017). Por ejemplo, la aplicación de un recubrimiento anti-biofilm, compuesto por una base de (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES) y una capa funcional de ácido acrílico, sobre acero inoxidable mediante polimerización por PANT permitió reducir hasta en un 90% la formación de biofilm por L. monocytogenes (Figura 5), gracias a sus características hidrofílicas y baja rugosidad (Fernández- Gómez et al., 2022). De forma similar, la aplicación de un recubrimiento de ácido acrílico sobre una superficie de ácido poli-láctico (PLA) obtenido mediante impresión 3D también resultó en un descenso, de un 47,7 %, del biofilm formado por este microorganismo patógeno (Muro- Fraguas et al., 2020).

CONCLUSIÓN

Aunque en esta revisión se ha puesto de manifiesto el gran potencial que presentan las tecnologías basadas en el plasma atmosférico no térmico para luchar contra los biofilms en la industria alimentaria, resulta evidente que su implementación requiere aún de un gran esfuerzo investigador.

Figura 4: Efectividad antimicrobiana del PAW frente a L. monocytogenes formando biofilms sobre acero inoxidable y poliestireno. 2 < 1,02. Adaptada de Fernández-Gómez et al. (2023).

Figura 5: Imágenes de microscopía electrónica de biofilms de L. monocytogenes formados tras 6 días a 12^oC sobre acero (A) con recubierto anti-biofilm de APTES y ácido acrílico y (B) sin recubrimiento.

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