Ana Sánchez-Arroyo^a, Laura Plaza-Vinuesa^a, José Miguel Mancheño^b, Blanca de las Rivas^a, Rosario Muñoz^a
a Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), CSIC, José Antonio Novais 6, 28040 Madrid
^b Instituto de Química-Física “Blas Cabrera” (IQFBC), CSIC, Serrano 117, 28006 Madrid

El uso de enzimas a nivel industrial, especialmente en sectores como la higiene y la alimentación no es algo nuevo. De hecho, su empleo ha permitido reducir el uso de productos químicos peligrosos, llevar a cabo reacciones en condiciones con menor requerimiento de energía haciéndolas más sostenibles, acelerar un proceso o simplemente crear nuevos productos [1] [2]. Además, las enzimas poseen la ventaja extra de que sus propiedades se pueden modificar mediante técnicas de ingeniería genética, con el fin de adaptarlas a una aplicación industrial determinada [1]. Dentro del sector de la alimentación, la industria láctea posee una larga tradición en el uso de proteasas para la fabricación de quesos, mientras que la industria panadera emplea lacasas y transglutaminasas para conseguir el fortalecimiento de las masas, entre otros ejemplos [1]. También en la alimentación animal se emplean enzimas, como las fitasas que llevan a cabo la degradación del ácido fítico en piensos destinados a animales no rumiantes [1]. Los requisitos para poder aplicar enzimas a gran escala en la industria alimentaria incluyen: i) seguridad, ii) eficacia, iii) bajo coste de producción y purificación de la enzima, iv) estabilidad en amplios rangos de temperatura, pH y en presencia de disolventes orgánicos [1].

La ocratoxina A (OTA) es una micotoxina que destaca por su prevalencia y toxicidad, por lo que su presencia en determinados alimentos está sometida a regulación en numerosos países, incluyendo la Unión Europea (Reglamento (UE) 2023/915 [3]). Esta toxina se encuentra comúnmente en diversas materias primas y productos alimentarios, pudiendo generarse durante el cultivo, procesado y almacenamiento de éstas, de forma que puede estar potencialmente presente en toda la cadena alimentaria [4].

Con el fin de garantizar la seguridad de los alimentos, es crucial reducir su presencia al mínimo posible con los medios técnicos disponibles. Las micotoxinas, incluyendo la OTA, son extremadamente estables y resistentes a los tratamientos físicos y químicos utilizados habitualmente en el procesado de alimentos y piensos. La aplicación de buenas prácticas de agricultura, un almacenamiento adecuado y una correcta implementación de los procedimientos de gestión de riesgos pueden mitigar la aparición de micotoxinas, pero no pueden eliminar este riesgo por completo. Por esta razón, el desarrollo de estrategias alternativas para reducir la contaminación por micotoxinas se considera un tema de investigación relevante, innovador y urgente, aunque desafiante [1].

MÉTODOS DE DESTOXIFICACIÓN DE OCRATOXINA A

Existen múltiples estudios enfocados a la búsqueda de métodos efectivos para la degradación de OTA, habiéndose explorado estrategias que incluyen métodos físicos, químicos y biológicos. Los métodos físicos y químicos presentan importantes limitaciones, como efectos adversos en la salud, disminución del valor nutricional de los productos o alteraciones de sus características organolépticas. En cambio, los métodos biológicos se consideran más prometedores, ya que permiten degradar la OTA sin generar compuestos tóxicos, son más respetuosos con el medio ambiente y pueden mantener la calidad de los alimentos [5].

En la literatura científica se han descrito microorganismos capaces de reducir la OTA mediante dos mecanismos: la adsorción a sus paredes celulares y la transformación enzimática [6]. La eliminación de la toxicidad de la OTA se logra a través de la hidrólisis de su enlace amida, lo que resulta en la formación de ocratoxina α y L-β-fenilalanina, ambos compuestos no tóxicos. Hay estudios que han identificado cepas bacterianas capaces de convertir la OTA en estos metabolitos. Sin embargo, en la mayoría de estas bacterias, las proteínas responsables de esta transformación no se han identificado.

Según la aplicación final, puede ser más conveniente utilizar microorganismos o enzimas. No obstante, desde una perspectiva práctica, las enzimas ofrecen ciertas ventajas adicionales en comparación con los microorganismos vivos, tales como actividades más uniformes y reproducibles, mayor facilidad de manejo y menores riesgos de seguridad y contaminación [2], además de las ya mencionadas previamente.

Existen comercializadas enzimas para el tratamiento de otras micotoxinas, como es el caso de ciertas fumonisinas y la zearalenona. En mayo de 2014, la empresa Biomin^® (actualmente perteneciente a DSM) recibió el primer dictamen positivo de la EFSA para el uso de una enzima purificada en piensos, la cual se trataba de una esterasa de Sphingopyxis sp. MTA144 producida en una cepa de Komagataella pastoris modificada genéticamente, esta enzima, capaz de biotransformar las fumonisinas, ha sido incluida en una fórmula patentada como FUMzyme^® incorporada en una matriz de maltodextrina y secada por pulverización [1]. Esta misma empresa, también ha lanzado al mercado recientemente otra formulación, ZENzyme^®, la cual contiene una enzima capaz de hidrolizar el enlace éster del anillo lactona de la zearalenona, convirtiéndola en un producto seguro para el consumo [7]. Sin embargo, y a pesar de la extensa literatura científica, todavía no existe una formulación análoga basada en el uso de enzimas para la destoxificación de la OTA.

ENZIMAS DESTOXIFICADORAS DE OCRATOXINA A

Se han identificado numerosas enzimas capaces de hidrolizar el enlace amida en la molécula de OTA con diversos grados de eficacia (Figura 1). Todas las enzimas conocidas hasta la fecha son hidrolasas de distintos tipos, principalmente peptidasas (EC 3.4).

La primera enzima con capacidad para degradar OTA que se describió fue la carboxipeptidasa A de páncreas bovino [8]. En cuanto a las enzimas microbianas, la primera en ser identificada fue una amidohidrolasa de Aspergillus niger UVK143, denominada ocratoxinasa, en referencia a su capacidad para degradar OTA [9].

Algunos estudios sobre la transformación enzimática de OTA se basan únicamente en la actividad degradadora observada en extractos libres de células. Por ejemplo, Cho y colaboradores (2016) informaron sobre la actividad degradadora de OTA en un extracto libre de células de un cultivo de Aspergillus tubingensis, sin llegar a determinar la enzima responsable de tal acción [10]. Otros estudios dan un paso más en la caracterización del agente de la transformación, determinando que las enzimas involucradas en la hidrólisis de OTA son metalocarboxipeptidasas, debido a la susceptibilidad de los cultivos y de los extractos libres de células a inhibidores específicos de este tipo de enzimas. Un ejemplo de esto es la carboxipeptidasa descrita en Phaffia rhodozyma CBS 5905 [11].

1. Enzimas que presentan baja eficacia en la destoxificación de OTA

Se han realizado estudios en los que se han identificado y purificado enzimas que potencialmente participan en la degradación de OTA. Entre las proteínas bacterianas identificadas se encuentran las carboxipeptidasas de Bacillus amyloliquefaciens ASAG1 [12], Bacillus subtilis CW14 [13][14], Lysobacter sp. CW239 [15] y Acinetobacter sp. neg1 [16]. Sin embargo, estas proteínas, aunque capaces de degradar OTA, no lo hacen de manera eficiente, sugiriendo que no son las principales responsables de la capacidad degradadora observada en los cultivos bacterianos. Por ejemplo, un lisado celular de Escherichia coli expresando la carboxipeptidasa recombinante PJ15_1540 de Acinetobacter sp. neg1 únicamente degradó el 33 % de la OTA presente en el medio [16], indicando una actividad enzimática mucho menor que la de la cepa original de Acinetobacter sp. neg1 [17].

Otros ejemplos incluyen la carboxipeptidasa cp4 de Lysobacter sp. CW239 y la amidohidrolasa NA de Stenotrophomonas sp. CW117, que mostraron una actividad degradadora de OTA moderada, resultando inferior a la observada en los cultivos de estas cepas [15][18]. Además, se observó actividad degradadora de OTA en un mutante deficiente en la carboxipeptidasa cp4 de Lysobacter sp. CW239 [19] y en una cepa deficiente en la amidohidrolasa NA de Stenotrophomonas sp. CW117 [18], lo que sugiere que estas no son las principales enzimas responsables del fenotipo degradador, y que algunas cepas pueden tener varias enzimas capaces de hidrolizar OTA, aunque algunas de ellas hidrolicen OTA con baja eficacia.

Asimismo, en nuestro grupo de investigación de Biotecnología Bacteriana del ICTAN-CSIC hemos descrito enzimas pertenecientes a microorganismos no degradadores de OTA, que una vez purificadas y en incubaciones prolongadas en presencia de éstas, son capaces de degradar la toxina. Este es el caso de la salicilato 1,2-dioxigenasa de Pseudaminobacter salicylatoxidans DSM 6986T [20] y una α/β hidrolasa de Acinetobacter tandoii DSM 14970T [21].

2. Enzimas muy eficaces en la destoxificación de OTA

En contraste con la baja actividad hidrolítica de OTA de las enzimas clasificadas como carboxipeptidasas, peptidasas, proteasas o hidrolasas, se han identificado una serie de proteínas clasificadas como “amidohidrolasas” muy eficaces en la degradación de OTA: la amidohidrolasa “ocratoxinasa” de A. niger UVK143 [9][22], la N-acil-L-aminoácido amidohidrolasa de Alcaligenes faecalis DSM 16503T [23][24], la amidohidrolasa ADH3 de la cepa Stenotrophomonas sp.CW117 [25], la amidohidrolasa ADH2 de Lysobacter sp. CW239 [26], las amidohidrolasas ADH1 y AMD3 de Silanimonas sp. CW282 y de Luteimonas sp.CW574, respectivamente [27], la amidohidrolasa PwADH de Pseudoxanthomonas wuyuanensis [28], la amidohidrolasa MbAmh1 de Metarhizium brunneum [29] y la amidohidrolasa BlOTA de Brevibacterium linens DSM 20425T [30]. Todas estas amidohidrolasas se han identificado en cepas bacterianas capaces de destoxificar OTA eficazmente.

La Tabla 1 muestra todas las enzimas conocidas hasta la fecha con capacidad para transformar OTA. En el caso de la N-acil-L-aminoácido amidohidrolasa de Alcaligenes faecalis DSM 16503T, se ha demostrado que, a pesar de la posible existencia de otras enzimas capaces de hidrolizar OTA, esta enzima es la responsable del fenotipo degradador de OTA en las especies del género Alcaligenes que presentan dicha capacidad [24].

CONCLUSIÓN

Las posibilidades del uso de enzimas en la industria alimentaria y de piensos siguen siendo muy amplias. Su aplicación es versátil, ya que pueden utilizarse tanto en forma libre como inmovilizada, lo que aporta ventajas adicionales como la posibilidad de implementar procesos continuos, la reutilización de las enzimas y la reducción de costes. Además, las enzimas pueden expresarse de forma heteróloga en microorganismos industriales, como bacterias del ácido láctico o levaduras, pudiendo ser integradas en procesos industriales ya establecidos [1].

Se han identificado numerosas enzimas con capacidad para degradar OTA con diferentes grados de eficacia.

Se han identificado bacterias con capacidad para degradar OTA pertenecientes a grupos taxonómicos muy variados e incluso, como se ha mencionado, se han encontrado enzimas con esta capacidad en microorganismos no degradadores de OTA. Estos hechos concuerdan con que las enzimas capaces de realizar esta degradación son generalmente peptidasas o amidohidrolasas, un tipo de enzima muy común. Las peptidasas identificadas suelen ser inespecíficas y su sustrato natural no ha sido definido, por lo que es probable que se trate de enzimas útiles para la adaptación de las bacterias a diferentes entornos con baja disponibilidad de aminoácidos. Entre las enzimas identificadas, mayoritariamente, se han descrito diferentes carboxipeptidasas, las cuales purificadas e incubadas de forma prolongada en presencia de OTA, son capaces de degradar la toxina. Por otra parte, también se ha demostrado la existencia de enzimas capaces de destoxificar OTA de forma eficaz, lo que las convierte en candidatos adecuados para su aplicación.

La posibilidad de desarrollar y comercializar enzimas destoxificadoras de OTA representa una oportunidad valiosa en la mitigación de riesgos alimentarios y de salud pública asociados a esta micotoxina, especialmente considerando que, como ya se ha mencionado, en el mercado ya existen dos precedentes de enzimas empleadas con éxito para la destoxificación de dos tipos de micotoxinas, fumonisinas y zearalenona. La aplicación de estas enzimas resulta bastante sencilla. Por ejemplo, en el caso de FUMzyme®, su aplicación consiste en solubilizar la enzima en agua y rociarla sobre el pienso o sobre el maíz (principal cereal afectado por fumonisinas) en el momento de la cosecha, según detalla la página web de la empresa [38] [39].

Como se ha observado, la cantidad de estudios en curso demuestra un esfuerzo continuo por encontrar enzimas que puedan destoxificar la OTA de manera eficaz. Sin embargo, hasta ahora, estos estudios se han centrado principalmente en identificar dichas enzimas. Los próximos desafíos para llegar a su aplicación industrial incluyen comprobar si estas enzimas son igualmente eficaces en destoxificar OTA en los distintos alimentos donde su presencia está regulada, como el vino, cereales, café y frutas desecadas. En este contexto, sería ventajoso contar con una variedad de enzimas con características fisicoquímicas diferentes, lo que permitiría una mayor adaptabilidad a diversos sustratos. Una vez validada su actividad en condiciones reales, el siguiente reto sería garantizar su estabilidad durante el almacenamiento y uso, preferiblemente a través de procesos como la liofilización. Por supuesto, el último reto sería demostrar la seguridad de su uso.

En conclusión, aunque nos encontremos en los estadios iniciales, se han descrito (y se continuarán describiendo) suficientes enzimas capaces de destoxificar OTA y existen ejemplos de éxito en este ámbito que apuntan que es cuestión de tiempo que progresivamente se consiga el desarrollo de una (o diferentes) formulación enzimática para la destoxificación de la OTA sobre diferentes alimentos.

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