José Alberto Serrano Lara¹, Guiomar Denisse Posada Izquierdo², Rosa María García Gimeno³
Dpto. de Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales
¹ serrano.lara2@yahoo.es / 647447938
² bt2poizg@uco.es / 957212000
³ bt1gagir@uco.es / 957212000

INTRODUCCIÓN

Como consecuencia del acelerado ritmo de vida que vive la sociedad actual, en el que la falta de tiempo para llevar a cabo las tareas cotidianas es una constante común entre la población, esta se ha visto obligada a cambiar su estilo de vida, y por ende sus hábitos alimenticios, debiendo frecuentemente almorzar en el propio lugar de trabajo o estudio, además de no disponer de demasiado tiempo para realizar actividades domésticas como ir al supermercado o cocinar, lo que ha derivado en un incremento en la demanda de alimentos listos para el consumo (ALC)⁽¹⁾.

Se define a los ALC como aquellos alimentos preparados por el productor para su consumo directo, sin necesidad de cocinarlos ni someterlos a ningún tratamiento térmico⁽²⁾. Es de resaltar que estos ALC no están exentos de peligros (físicos, químicos y biológicos), que pueden afectar a la inocuidad de estos, cuya presencia podría provocar enfermedades transmitidas por alimentos u otros riesgos relacionados. Dentro de estos peligros, son de vital importancia los de tipo microbiológico, ya que, si los alimentos no se preparan bajo unas óptimas condiciones higiénicas y de seguridad, son un potencial medio para el crecimiento y multiplicación de diversos microorganismos patógenos de interés en Salud Pública. Dentro de los microorganismos patógenos con mayor prevalencia en ALC, encontramos a Listeria monocytogenes⁽³⁾, Escherichia coli, Salmonella spp y Staphylococcus aureus⁽⁴⁾, siendo Listeria monocytogenes el patógeno más frecuentemente asociado a este tipo de alimentos⁽⁵⁾, lo que implica la implantación de sólidas medidas higiénico-sanitarias para su prevención y control, implantadas principalmente por dos tipos de actores, como son los operadores alimentarios y la Autoridad Sanitaria, cada uno con sus competencias y responsabilidades correspondientes. Por un lado, los operadores alimentarios que fabrican y ponen en el mercado ALC están obligados a controlar el riesgo de presencia de L. monocytogenes a lo largo de toda la vida útil de sus productos, debiendo cumplir un límite legal de 100 UFC/g a final de vida útil o, en el caso de ALC destinados a lactantes y usos médicos especiales, ausencia en 25g de producto⁽⁶⁾. Por otro lado, el Control Sanitario Oficial (CSO) se encarga de velar por el cumplimiento de estos criterios microbiológicos confiando, la mayoría de las ocasiones, en revisiones bibliográficas desactualizadas o estudios de vida útil realizados por las mismas empresas, los cuales no tienen en cuenta condiciones reales de composición, transporte y comercialización.

Por ello, la microbiología predictiva, tal como especifica el Anexo II del Reglamento (CE) 2073/2005 (UE, 2005), se presenta como una herramienta para ayudar en ambos sentidos, basándose en la aplicación de modelos matemáticos para predecir el comportamiento de los microorganismos en un alimento, según variables ambientales reproductibles, como el grado de acidez, humedad, envasado en atmosfera modificada, temperatura, etc., cuyos efectos sinérgicos influyen entre sí para ejercer mayor o menor grado de protección frente a la alteración microbiana⁽⁷⁾. La utilización de este instrumento predictivo puede suponer una garantía en los Sistemas de Autocontrol de las empresas alimentarias, reduciendo análisis microbiológicos y sus costes⁽⁸⁾, así como validación de la vida útil ante las Autoridades Sanitarias. Además, cabe destacar que, para el ámbito del CSO, el uso de la microbiología predictiva supone una herramienta actualizada y validada científicamente de forma independiente para corroborar el crecimiento y supervivencia de microorganismos patógenos en el producto final, en base a las características fisicoquímicas del alimento, así como a las temperaturas de conservación indicadas en el etiquetado y empleadas en las instalaciones y transporte de la empresa, las cuales se pueden verificar fácilmente durante la visita de inspección.

En el presente trabajo, se han seleccionado y caracterizado determinados grupos de ALC, como productos lácteos (queso fresco), productos cárnicos procesados (embutidos) y productos de origen vegetal (gazpacho fresco, crema de calabaza), sometidos posteriormente a microbiología predictiva mediante el uso de diferentes software, con el propósito de evaluar el comportamiento de los microorganismos al ser sometidos a diferentes variables ambientales como temperatura (Tª), pH, a_w, etc., cuyos resultados nos aporta información sobre la eficacia del uso de esta herramienta en la prevención y control de peligros biológicos en ALC. El presente trabajo se ha centrado en el estudio de Listeria monocytogenes, al tratarse del patógeno más frecuentemente asociado a los ALC⁽⁷⁾.

MATERIAL Y MÉTODOS

Como población de estudio, se han seleccionado ALC presentes en tres de los supermercados más frecuentados en España, como son Mercadona S.A., Lidl Supermercados S.A. y Centros Comerciales Carrefour S.A., llevándose a cabo un muestreo de estos en base a una categorización determinada. Concretamente, se han seleccionado ALC englobados en tres categorías, que son: categoría 1 (productos lácteos-quesos frescos), categoría 2 (productos cárnicos procesados-embutidos) y categoría 3 (productos vegetales). De cada categoría se han seleccionado tres alimentos al azar y fueron caracterizados en base a sus características físico- químicas e información del etiquetado. La medición del pH se ha realizado con un pHmetro calibrado de la marca Hanna Foodcare HI981034 portátil y la a_w se ha obtenido de forma indirecta con la ayuda de la aplicación Combase(www.combase.cc), a través del dato de % sal presente en el alimento.

En lo que respecta al procedimiento propiamente dicho, se utilizaron diferentes aplicaciones de microbiología predictiva de uso gratuito y fácilmente manejable por el usuario (Tabla 1), con el objetivo de estimar el riesgo de crecimiento del patógeno dentro de la vida comercial de cada producto, cuando este es sometido a hipotéticos escenarios ambientales.

Para la evaluación de esta parte práctica, se han analizado las curvas de crecimiento microbiano, centrándose en dos parámetros fundamentalmente, como son la tasa máxima de crecimiento del patógeno (μmax, en log/h) y el tiempo necesario para alcanzar 2 logaritmos, es decir: 100 UFC/g (t 2log, en horas). Este último se corresponde al límite legal establecido por la normativa vigente para Listeria monocytogenes. Hay que destacar que, de los modelos a utilizar, se diferencia entre aquellos desarrollados en alimentos y los desarrollados en medio de cultivo, siendo estos últimos, medios que favorecen el crecimiento del patógeno, por lo que se parte de que las estimaciones realizadas siempre serán “conservadoras”, es decir, existirá un crecimiento más rápido que en el propio alimento, ya que el alimento es una matriz más compleja.

En lo que respecta a la temperatura (Tª), factor determinante en el crecimiento del patógeno, indicar que los alimentos son sometidos a la Tª máxima de conservación estipulada en el etiquetado. Además, y con el fin de evaluar una hipotética pérdida de la cadena de frío (almacenamiento, transporte, distribución, etc.), se sometió a cada uno de ellos a incrementos de Tª simulada, aumentando la misma a 8º y 12ºC. En el caso de los productos cárnicos-embutidos, cuya conservación se lleva a cabo a Tª de refrigeración algo más flexible (8ºC) o a Tª ambiente (15º-20ºC), según el caso, se incrementa su Tª máxima de almacenamiento 8ºC y 8ºC con respecto a su Tª máxima de conservación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos figuran en las Tablas 2, 3 y 4, indicándose el tipo de estudio (E*) mediante una M, cuando este se realiza sobre medio de cultivo, y mediante una A, cuando se realiza sobre el alimento en sí.

Para los alimentos seleccionados, no se han encontrado modelos elaborados ni validados en la aplicación CB Premium, a excepción de la categoría de productos lácteos–quesos frescos, en la que se ha utilizado el modelo en alimentos Listeria monocytogenes in semi-soft rind washed pasteurized milk cheese, por su similitud con el primer producto descrito y caracterizado (queso fresco de vaca y cabra).

1ª Categoría (ALC productos lácteos-queso fresco).

Para la aplicación PMP, se utilizó el modelo Listeria monocytogenes growth aerobic (broth culture), desarrollándose sobre medio de cultivo. Se calcula el tiempo en incrementar 2 log (100 UFC/g), como criterio de riesgo, en este caso el tiempo que transcurre desde el incremento de 3 log a 5 log (+2 log), ya que el modelo establece 3 log como valor inicial por defecto. El modelo estima, para los tres productos caracterizados, un tiempo superior al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante. Por lo tanto, este modelo considera los alimentos seguros para el riesgo de L. monocytogenes durante toda su vida comercial, siempre y cuando se respete el modo de conservación en frío descrito en el etiquetado. Con respecto a la simulación de una posible pérdida de la cadena de frío, se observa una disminución considerable de la vida útil de los alimentos como consecuencia de un crecimiento más rápido del patógeno.

Por otro lado, se ha aplicado el programa Combase, donde se utilizó el modelo Listeria monocytogenes/ innocua (growth model) (basado en medio de cultivo), obteniendo unos resultados similares al PMP. En él, se calculó el tiempo en alcanzar 2 log (100 UFC/g), resultando este tiempo superior al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante y, por lo tanto, el modelo considera los alimentos seguros para el riesgo de L. monocytogenes. Sin embargo, para el caso del queso de cabra madurado con moho, se obtiene como estimación un tiempo inferior al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante, por tanto, el modelo no considera este alimento seguro para el riesgo de L. monocytogenes. Con respecto a la simulación de la pérdida de la cadena de frío, los datos resultantes nos muestran la misma situación que la descrita anteriormente.

En lo que respecta al CBpremium, indicar que se trata de una aplicación que utilizó modelos en alimentos, habiendo utilizado para este alimento en concreto, el modelo Listeria monocytogenes in semi-soft rind washed pasteurized milk cheese, por presentar cierta similitud, cuyos resultados evidencian cierta aceleración del crecimiento de L. monocytogenes, lo que deriva en la disminución de su vida comercial. Este hecho, probablemente, este motivado por la limitación del programa de agregar más factores físico-químicos (pH, a_w, % sal, etc.), que obstaculizarían la proliferación bacteriana, ya que solo atiende al factor Tª. Por último, se aplica microHibro, utilizando en este caso un modelo sobre el ingrediente principal (queso tierno), considerando, en base a la Tª y vida útil indicada por el fabricante, un alimento seguro el queso fresco de cabra y vaca, y como no seguros los dos productos restantes (queso fresco batido y queso de cabra madurado con moho). No obstante, este modelo presenta las mismas limitaciones que el modelo Cbpremium (único factor Tª), no teniendo en cuenta otros factores fisicoquímicos inherentes a los alimentos que inhibirían en cierta proporción el crecimiento del patógeno, lo que redunda en la fiabilidad de la estimación.

Como conclusión, en los ALC seleccionados en esta categoría (productos lácteos – quesos frescos), se seleccionaría el modelo predictivo PMP como la aplicación más idónea para la estimación del crecimiento de L. monocytogenes, ya que nos permite introducir un mayor número de parámetros físico-químicos, hecho que redunda en la fiabilidad de nuestra estimación, en contraposición del resto de modelos estudiados, donde este aspecto presenta limitaciones. Además, significar que los resultados obtenidos ponen de manifiesto la importancia del etiquetado como herramienta eficaz para garantizar un consumo seguro del alimento por parte del consumidor, en este caso, especificando las condiciones óptimas de conservación del mismo.

2ª Categoría (ALC productos cárnicos-embutidos).

En primer lugar, se ha utilizado la aplicación PMP, seleccionando el modelo Listeria monocytogenes growth anaerobic (broth culture), desarrollado sobre medio de cultivo en condiciones de anaerobiosis. Esta aplicación permite introducir varios datos relativos a los factores físico-químicos inherentes al alimento, como son el pH, % sal y nitritos. Estos últimos son característicos de los productos cárnicos curados, correspondiendo al uso de aditivos conservadores como son el nitrito sódico (E-250) y nitrato potásico (E-252), habiendo introducido en la aplicación un valor de 100 ppm, el cual está dentro del rango permitido legalmente. Una vez introducidos todos los valores, se calcula el tiempo en incrementar 2 logaritmos (100 UFC/g), obteniendo una estimación considerablemente inferior al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante, dato incoherente teniendo en cuenta que se trata de un producto curado con una vida útil prolongada en óptimas condiciones de conservación, por lo que, se deduce que el modelo no es el idóneo para estimar el riesgo de proliferación del patógeno, ya que además de no haber tenido en cuenta el resto de ingredientes que influyen en su crecimiento (especias, antioxidantes, estabilizadores, etc.), partimos de la base que la modelización no se realiza sobre el alimento sino en un medio de cultivo, el cual es más conservador.

Para la aplicación Combase, se utilizó el modelo Listeria monocytogenes/innocua- nitrite (Growth model), con similares características al utilizado para la aplicación PMP, presentando los mismos parámetros físico- químicos a introducir (pH, % sal, nitritos). Del mismo modo, se muestran unos resultados análogos al anterior, considerando que el patógeno llegará a 100 UFC/ml en un tiempo relativamente corto.

En el caso de microHibro, tanto para el chorizo ibérico como para el salchichón de pueblo, se ha utilizado el modelo microbiano en medio de cultivo Te Giffel & Zwietering (1999); Listeria monocytogenes; Multifoods, validado para productos crudos curados. Los resultados predictivos indican, que a Tª ambiente de conservación (15ºC), no existirá crecimiento durante toda la vida comercial del producto, por tanto, establece este alimento como seguro. Resaltar, que tampoco se evidencia crecimiento de este patógeno tras simular un incremento de Tª 4ºC y 8ºC.

Para el caso de la morcilla serrana ibérica, se ha utilizado el modelo microbiano específico para productos cocidos; Listeria monocytogenes; Mejlholm & Dalgaard (2009), validado para este tipo de alimentos. Como resultado, se obtiene un rápido crecimiento (> 2 log) dentro del periodo de vida útil estipulado por el fabricante, considerando, por ende, el alimento como no seguro. Lo más probable es que exista un error de estimación en este resultado, debido a que, durante su aplicación, como se trata de un modelo multiparamétrico, los datos introducidos se han limitado a los parámetros de a_w, pH y Tª, no habiendo cumplimentado los datos de CO_2eq, nitritos, fenol y ácido láctico, al no disponer de los mismos. Estos componentes, aparte de las ya conocidas características organolépticas que aportan al producto (sabor, aroma, color), también participan en la prolongación de la vida útil de los productos, de ahí la importancia de realizar una correcta caracterización de los productos.

Como conclusión, en los ALC seleccionados en esta categoría (productos cárnicos – embutidos), se descartarían modelos como el PMP y Combase, ya que no tienen en cuenta ciertos parámetros inherentes a este tipo de alimentos (conservantes y resto de aditivos), además de desarrollarse en modelos de medios de cultivo (conservadores). Por otro lado, se podría elegir la aplicación microHibro como la más idónea para estimar el riesgo, ya que, además de que existen modelos validados en este tipo de alimentos (productos cárnicos curados y cocidos), nos da la posibilidad de introducir parámetros inherentes a estos productos, hecho que redundará en la fiabilidad de nuestra estimación, en contraposición del resto de modelos estudiados, donde este aspecto presenta limitaciones.

3ª Categoría (ALC productos vegetales).

Para la aplicación de PMP, se utilizó el modelo en medio de cultivo Listeria monocytogenes growth aerobic (broth culture). En el caso del gazpacho fresco, el t 2log (h) resultante no se corresponde al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante, estando incluso muy por encima. Por lo tanto, el modelo considera, teóricamente, el alimento seguro para el riesgo de L. monocytogenes. Posiblemente, la utilización de este modelo para este producto en concreto, dadas sus características, presente un elevado error de estimación, ya que se le atribuye una vida útil muy larga sin haber sido sometido a un tratamiento térmico previo (pasteurización o esterilización). Consecuentemente, se debería estimar el riesgo con otros modelos a fin de establecer comparativas o de mejor forma, someter al producto a ensayos de desafío o pruebas de durabilidad. Para el caso de la crema de calabaza, se obtiene como resultado un crecimiento rápido del patógeno, no correspondiendo su vida útil a efectos de inocuidad al tiempo de duración mínima establecida por el fabricante y, por lo tanto, el modelo considera el alimento como no seguro para el riesgo de L. monocytogenes. Probablemente, el modelo no ha tenido en cuenta el procesado al que ha sido sometido el producto, en este caso a altas presiones hidrostáticas, proceso tecnológico que permite alargar la vida útil de los alimentos, respetando las características organolépticas e influyendo en la viabilidad de los microorganismos, provocándoles alteraciones morfológicas ⁽⁹⁾ y en su material genético ⁽¹⁰⁾.

Del mismo modo, con respecto a la aplicación Combase, donde se utilizó el modelo de cultivo Listeria monocytogenes/innocua (growth model), se han obtenido estimaciones similares al PMP.

En el caso de microHibro, tampoco existen modelos sobre estos alimentos en sí, por lo que se realiza una búsqueda sobre los modelos desarrollados en medio de cultivo, donde el crecimiento es favorable. En estos casos, se selecciona el modelo caldo infusión de cerebro y corazón; Listeria monocytogenes, que resulta en una tasa de crecimiento muy superior, pero no tiene en cuenta el valor de pH ácido del producto, motivo que justifica que la estimación del incremento de riesgo de L. monocytogenes sea anterior al período de vida útil. Lógicamente, a medida que incrementamos la Tª, la tasa de crecimiento será mayor, como se muestran en los resultados.

Como conclusión, en los ALC seleccionados en esta categoría (productos vegetales), se observa que, en las tres aplicaciones utilizadas, donde se han utilizado modelos basados en medios de cultivo, las estimaciones resultantes parecen ser incongruentes, posiblemente porque la matriz de estudio no sea la idónea. No obstante, se debe comparar las predicciones generadas por el modelo con observaciones reales análogas y dentro del dominio experimental ensayado (rango de pH, Tª, etc.), para determinar así el comportamiento del modelo en condiciones reales.

En los casos en los que una adecuada microbiología predictiva no garantice el límite de 100 UFC/g en los ALC antes del fin de su vida útil, existen otro tipo de herramientas utilizadas como alternativas para justificar la misma, como son la realización de pruebas de durabilidad y la realización de ensayos de desafío (Challenge Test), ambas reflejadas en el Anexo II del Reglamento 2073/2005.

CONCLUSIONES

En ALC de cierta complejidad (compuestos por múltiples ingredientes y sometidos a procesos tecnológicos), como son la mayoría de los seleccionados en el presente trabajo, resulta difícil encontrar modelos desarrollados en alimentos, por lo que, en estos casos, siempre será conveniente la búsqueda de modelos sobre medio de cultivo, aunque sus estimaciones sean más conservadoras, pero ello redundará en una mayor seguridad. Para una correcta aplicación de los modelos predictivos resulta indispensable realizar una adecuada caracterización del producto, así como tener en cuenta las condiciones de conservación razonablemente previsibles.

La microbiología predictiva es una herramienta útil para la prevención y control de Listeria monocytogenes en Alimentos Listos para el Consumo (ALC), existiendo una amplia gama de programas y aplicaciones de microbiología predictiva fácilmente accesibles, que nos permite realizar estimaciones de riesgo de forma sencilla e intuitiva. No obstante, deben seguir implementándose estudios que incrementen la información disponible y, sobre todo, amplíen el catálogo de alimentos, ya que existen multitud de matrices alimentarias sobre las que no existen modelos para un patógeno tan frecuente en la industria alimentaria como es Listeria monocytogenes, estrechamente asociado a los ALC.

Tabla 1.- Información de las aplicaciones informáticas utilizadas para las predicciones.

^{REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS}

^{(1)   Martínez-Álvarez, O.; Iriondo-DeHond, A.; Gómez-Estaca, J.; Del Castillo, M.D.; Nue- vas tendencias en la producción y consumo alimentario. Revista Distribución y consumo, Vol. 1. (165): 51-62.   2021. https://digital.csic. es/bitstream/10261/253463/1/nuevaten- dealimen.pdf}

^{(2)    EFSA (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria). https://www.efsa.europa.eu/ es/glossary/ready-eat-food. Consultado: 2 noviembre 2023}

^{(3)     Lomonaco, S., Nucera, D., & Filipello, V. The evolution and epidemiology of Listeria monocytogenes in Europe and the United States. Infection, Genetics and Evolution, 35, 172-183. 2015. https://doi.org/10.1016/j. meegid.2015.08.008}

^{(4)     Mengistu, D. A., & Tolera, S. T. Prevalence of Microorganisms of Public Health Significance in Ready-to-Eat Foods Sold in Developing Countries: Systematic Review and Meta-Analysis. International Journal of Food Science, 2020, 1-9. 2020. https://doi. org/10.1155/2020/8867250}

^{(5)     AESAN (Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición); 2022. Listeriosis. https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/ seguridad_alimentaria/subdetalle/listeria. htm Consultado: 2 noviembre 2023}

^{(6)     Reglamento (CE) 2073/2005 de la Comisión, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios. https://eur-lex. europa.eu/legal-content/ES/TXT/?uri=CEL- EX%3A02005R2073-20200308&q id=1623550483802}

^{(7)     AESAN (Agencia Española de Seguridad Al- imentaria y Nutrición); Documento de orientación para la verificación de estudios de vida útil en relación con Listeria monocytogenes en alimentos listos para el consumo. 2019. https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/ noticias_y_actualizaciones/noticias/2019/ verificacion_vida_util.htm}

^{(8)     Alapont, C.; Simón, P; Torrejón, M.J.; Guía para la determinación de la vida útil de los alimentos. Food Standard Agency (FSAI); Conselleria de Sanitat Universal I Salut Pública de la Generalitat Valenciana. 2017. https://www. fedacova.org/wp-content/uploads/2020/11/ G u i a -D e t e r m i n a ci % C 3 % B 3 n - Vi - da-%C3%9Atil-2020.pdf}

^{(9)     Raventós Santamaría, M. Industria alimentaria, tecnologías emergentes. Barcelona: Ediciones Universidad Politécnica de Cataluña. 2003.}

^{(10)   Cheftel, J.C. Effect of high hydrostatic pressure on food constituents: an overview. High Pressure and Biotechnology, C. Balny, R. Hayashi, K. Heremans, P. Masson (ed), 195-209. Editions John Libbey Eurotext, Mon- trouge. 1992.}