^{Rosario Muñoz *, Blanca de las Rivas, Héctor Rodríguez 1, María Esteban-Torres, Laura Santamaría, José María Landete 2, Laura Plaza-Vinuesa, Ana Sánchez-Arroyo, José Antonio Curiel 2,*}

^{Biotecnología Bacteriana, Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN), CSIC, José Antonio Nováis 6, 28040 Madrid}

^{1 Dirección actual: Laboratorio de Inflamación y Plasticidad de Macrófagos, CIC bioGUNE-BRTA, Derio (Vizcaya)
2 Dirección actual: Departamento de Tecnología de Alimentos, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), CSIC, Madrid.
José Antonio Curiel* (913476886, joseantonio.curiel@inia.csic.es) *autor para correspondencia Rosario Muñoz (913938074, r.munoz@csic.es) *autor para correspondencia}

1. INTRODUCCIÓN

Los compuestos fenólicos son constituyentes de los alimentos vegetales y su consumo en la dieta está asociado con una menor incidencia de algunas enfermedades. Los efectos beneficiosos de los compuestos fenólicos dependen de su biodisponibilidad y, por consiguiente, de su grado de biotransformación. Aunque en la digestión de los alimentos vegetales participan microorganismos y enzimas gastrointestinales, sin embargo, la fermentación de estos alimentos es el método biotecnológico más eficaz para aumentar la biodisponibilidad y bioaccesibilidad de los polifenoles, a la vez que preserva y mejora las propiedades de los alimentos (1).

Numerosos sustratos vegetales se fermentan con bacterias lácticas, siendo Lactiplantibacillus plantarum la especie más frecuentemente responsable de estas fermentaciones (2). Parte del éxito de L. plantarum para fermentar alimentos vegetales reside en su capacidad metabólica para transformar los compuestos fenólicos, y puesto que este papel es decisivo en la actividad biológica de los compuestos producidos, en esta revisión se resume el conocimiento actual sobre el metabolismo de compuestos fenólicos en esta bacteria láctica.

2. ACTIVIDAD DE L. PLANTARUM SOBRE COMPUESTOS FENÓLICOS GLICOSILADOS

Entre los polifenoles de la dieta, los flavonoides son los compuestos fenólicos más abundantes, y se encuentran generalmente glicosilados, lo que reduce su absorción intestinal. Por ello, la hidrólisis de estos compuestos glicosilados libera la aglicona, que presenta mayor biodisponibilidad y actividad biológica que el glicósido original (3). Las gliconas presentes en estos compuestos suelen ser residuos de glucosa (como en apigenin-8-C- glucósido, kaempferol-3-O-glucósido, quercetina-3-O-glucósido, miricetina-3-O-glucósido, etc), galactosa (p. ej., kaempferol-3-O-galactósido), ramnosa (p. ej., 2,3-dihydroquercetina-3-O-ramnósido), y xilosa (como 2,3-dihydroquercetina-3-O-xilósido, entre otros).

En L. plantarum se describió por primera vez la capacidad para hidrolizar compuestos fenólicos glicosilados al estudiar el metabolismo de la oleuropeína, el principal compuesto fenólico glucosilado del fruto y de las hojas del olivo. A pesar de que distintos estudios han descrito la purificación de enzimas con actividad β-glucosidasa en L. plantarum (4, 5), recientemente se ha demostrado que las cepas de L. plantarum no poseen ninguna enzima con actividad β-lucosidasa, sino que poseen enzimas con actividad fosfo-β-glucosidasa, las cuales son las responsables de la actividad β-glucosidasa observada en los cultivos de L. plantarum (6). De esta manera, los β-glucósidos se hidrolizan a través de un proceso que los introduce en el citoplasma y simultáneamente los fosforila a fosfo-β- glucósidos mediante un sistema de fosfotransferasas.

Ya en el interior celular, los fosfo-β-glucósidos se hidrolizan a sus correspondientes agliconas mediante la acción de las fosfo-β-glucosidasas (6). La cepa L. plantarum WCFS1 posee 11 glicosidasas de la familia GH1 que presentan actividad 6-fosfo-β-glucosidasa, pero que no poseen actividad β-glucosidasa. Ocho de estas glicosidasas GH1 también presentan actividad 6-fosfo-β-tioglucosidasa y pueden ser responsables de la hidrólisis de glucosinolatos aromáticos, como la sinalbina (6).

L. plantarum WCFS1 posee además enzimas con actividad glicosidasa sobre compuestos fenólicos unidos a residuos de galactosa (7) o ramnosa (8), siendo esta ramnosidasa capaz de hidrolizar rutina (quercetina-3-O-ramnoglucósido), un flavonoide abundante en la dieta.

3. METABOLISMO DE L. PLANTARUM EN COMPUESTOS DERIVADOS DEL ÁCIDO HIDROXIBENZOICO

Los ácidos fenólicos son el segundo grupo más importante de compuestos fenólicos y representan casi un tercio de los polifenoles de la dieta. Los ácidos fenólicos poseen dos estructuras químicas diferenciadas: las estructuras derivadas del ácido hidroxibenzoico y las derivadas del ácido hidroxicinámico. Aunque el esqueleto básico es el mismo, el número y la posición de los grupos hidroxilo en el anillo aromático crean una gran variedad de estructuras. Los compuestos derivados del ácido hidroxicinámico poseen un esqueleto C6-C3, siendo el ácido ferúlico, el ácido p-cumárico y el ácido cafeico algunos ejemplos de esta clase (Figura 1). Por su parte, los compuestos derivados de los ácidos hidroxibenzoicos (C6-C1) se encuentran principalmente en forma de ésteres, siendo los ácidos más comunes los ácidos gálico, vanílico y siríngico (Figura 1).

Se ha estudiado la capacidad de L. plantarum para metabolizar compuestos derivados del ácido hidroxibenzoico. Entre los compuestos complejos metabolizados se encuentra el ácido tánico, un tanino hidrolizable formado por ésteres del ácido gálico (9). L. plantarum inicialmente hidroliza los ésteres del ácido gálico, mediante la acción de una enzima esterasa (hidroxibenzoil esterasa, tanasa o galoil/ protocatechuoil esterasa) para liberar moléculas de ácido gálico. El ácido gálico liberado se descarboxila posteriormente para formar pirogalol por acción de una enzima descarboxilasa (hidroxibenzoato descarboxilasa). Los ésteres del ácido protocatéquico se transforman mediante la misma ruta que los ésteres del ácido gálico, para obtener catecol (10).

3.1. Hidroxibenzoil esterasa (tanasa o galoil/ protocatechuoil esterasa) L. plantarum hidroliza los taninos hidrolizables y ésteres de ácidos hidroxibenzoicos (gálico/protocatéquico) por la acción de una enzima con actividad esterasa liberando los correspondientes monómeros de ácido fenólico (Figura 2).

Osawa y cols. (2000) (11) describieron por primera vez la actividad de la hidroxibenzoil esterasa (tanasa) en L. plantarum, siendo Iwamoto y cols. (2008) (12) quienes posteriormente identificaron el gen que codifica una enzima esterasa intracelular en L. plantarum WCFS1 (tanLp1, tanBLp o lp_2956). Más tarde se anotó un locus diferente como “tanasa” (o tanALp; HMPREF0531_11,477) y se demostró que también codifica una enzima esterasa en L. plantarum ATCC 14917T, pero en este caso una esterasa extracelular (13). Se estudió la presencia de ambos genes en distintas cepas de L. plantarum, concluyéndose que la esterasa intracelular TanBLp está presente en todas las cepas analizadas. Por el contrario, la esterasa extracelular TanALp sólo está presente en un reducido número de cepas (13). Las dos esterasas se sobreexpresaron de forma heteróloga en Escherichia coli y se purificaron y caracterizaron las enzimas recombinantes producidas (13, 14). Se demostró que ambas esterasas presentan espectros de sustrato similares, hidrolizando ésteres de sólo dos ácidos hidroxibenzoicos, del ácido gálico y del ácido protocatéquico (Tabla 1). Sin embargo, TanALp no hidrolizó eficazmente los ésteres de ácido gálico con una cadena alifática larga. Por otro lado, la actividad específica de la esterasa extracelular, TanALp, es menor que la actividad de la esterasa intracelular TanBLp (Tabla 1). Entre las bacterias lácticas sólo se ha encontrado la presencia de la esterasa intracelular TanBLp en especies del grupo L. plantarum, compuesto L. plantarum, L. pentosus y L. paraplantarum, y en las cepas de Streptococcus gallolyticus (14).

3.2. Hidroxibenzoato descarboxilasa (galato/ protocatecuato descarboxilasa)

En el año 2000 se describió por primera vez la capacidad de L. plantarum para descarboxilar el ácido gálico (11). Sin embargo, fue en el año 2013 cuando se identificó en L. plantarum WCFS1 la enzima capaz de descarboxilar los ácidos gálico y protocatéquico (15). La hidroxibenzoato descarboxilasa identificada está compuesta por tres subunidades LpdB, LpdC y LpdD. Las subunidades LpdC (Lp_2945) y LpdB (Lp_0271) son esenciales para la actividad descarboxilasa, mientras que LpdB actuaría como flavin preniltransferasa produciendo FMN prenilado, que es el cofactor necesario para la actividad de LpdC (16).

A diferencia de la actividad hidroxibenzoil esterasa, la actividad hidroxibenzoato descarboxilasa se encuentra presente en numerosas especies de bacterias lácticas, destacando especies del grupo L. plantarum, así como Enterococcus faecium y Levilactobacillus brevis (16, 17).

4. METABOLISMO DE L. PLANTARUM EN COMPUESTOS DERIVADOS DEL ÁCIDO HIDROXICINÁMICO

Los compuestos fenólicos derivados del ácido hidroxicinámico son más abundantes que los derivados del ácido hidroxibenzoico e incluyen principalmente a los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico, los cuales se encuentran generalmente en forma glicosilada o esterificada a las estructuras vegetales. El metabolismo de los compuestos derivados del ácido hidroxicinámico en L. plantarum es más complejo que el de los derivados del ácido hidroxibenzoico. En ambos tipos de ácidos, los ésteres se hidrolizan por acción de una esterasa, y el correspondiente ácido fenólico producido se descarboxila por acción de una descarboxilasa. Sin embargo, en los ácidos hidroxicinámicos, L. plantarum posee dos enzimas con actividad reductasa, una de ellas es capaz de reducir los ácidos liberados por acción de la esterasa (hidroxicinamato reductasa) y la otra es capaz reducir los fenoles formados por acción de la descarboxilasa (vinilfenol reductasa) (Figura 3).

Los ésteres de los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico se hidrolizan por acción de una hidroxicinamoil esterasa (feruloil esterasa) para dar lugar a los correspondientes ácidos libres (p-cumárico, cafeíco, ferúlico y sinápico). Estos ácidos, junto con los ácidos m-cumárico y o-cumárico, se pueden reducir por acción de la hidroxicinamato reductasa para obtener los correspondientes ácidos fenilpropiónicos derivados (Figura 3).

Además de reducir directamente los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico, L. plantarum puede descarboxilar estos ácidos, por acción de una hidroxicinamato descarboxilasa para originar los correspondientes vinil fenoles (4-vinilfenol, 4-vinilcatecol y 4-vinilguaiacol, respectivamente). Estos vinilfenoles se pueden reducir posteriormente por acción de una enzima vinilfenol reductasa y originar los correspondientes etilfenoles (4-etilfenol, 4-etilcatecol y 4-etilguaiacol, respectivamente) (Figura 3).

Los compuestos obtenidos mediante la descarboxilación de los ácidos hidroxicinámicos, 4-vinilfenol y 4-vinilguaiacol, son aditivos alimentarios aprobados como aromatizantes. Por otro lado, los compuestos originados por la reducción de los etilfenoles, 4-etilfenol y 4-etilguayacol, aunque confieren sabores desagradables al vino, se consideran importantes componentes de sabor de la salsa de soja fermentada.

4.1. Hidroxicinamoil esterasa (feruloil esterasa)

Las enzimas hidroxicinamoil esterasas, más conocidas como feruloil esterasas, liberan algunos ácidos fenólicos, como los ácidos p-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico, de las paredes celulares de las plantas.

Al igual que ocurre con la hidroxibenzoil esterasa (tanasa), la cepa L. plantarum WCFS1 no posee una hidroxicinamoil esterasa extracelular. L. plantarum WCFS1 posee al menos una esterasa intracelular, Lp_0796, capaz de hidrolizar ésteres de los ácidos p-cumarico, cafeico, ferúlico y sinápico (18). Sin embargo, otras cepas de L. plantarum poseen también hidroxicinamoil esterasas o feruloyl esterasas extracelulares, como por ejemplo, la esterasa Est_1092 presente en las cepas L. plantarum JDM1 o L. plantarum DSM 1055 (19). Cuando se estudió la presencia de ambos genes en distintas cepas de L. plantarum se comprobó que la esterasa intracelular está presente en todas las cepas analizadas, mientras que la esterasa Est_1092 sólo está presente en un reducido número de estas cepas (19).

Con el objetivo de estudiar las propiedades de las enzimas hidroxicinamoil esterasas (feruloil esterasas) de L. plantarum, Est_1092 y Lp_0796 se hiperprodujeron de forma recombinante en E. coli, se purificaron y caracterizaron bioquímicamente (18, 19). Además de por su localización celular, ambas esterasas se diferencian claramente por su especificidad del sustrato. Lp_0796 hidroliza eficientemente los ésteres de ácidos hidroxicinámicos, como los ácidos cafeico, p-cumárico, ferúlico y sinápico, que son los cuatro sustratos modelo para las enzimas feruloil esterasas, así como los ésteres de los ácidos vanílico y benzoico (18). Sin embargo, la esterasa Est_1092 no sólo es capaz de hidrolizar los ésteres de los ácidos hidroxicinámicos, sino que también hidroliza todos los ésteres de los ácidos hidroxibenzoicos ensayados (19). Puesto que la actividad esterasa sobre ésteres de ácidos hidroxibenzoicos es inusual en las feruloil esterasas, Est_1092 es la primera esterasa descrita en una bacteria láctica que es activa frente a ésteres de ambos tipos de ácidos fenólicos.

4.2. Hidroxicinamato reductasa

Como se ha comentado anteriormente, las cepas de L. plantarum poseen una ruta capaz de reducir directamente los ácidos hidroxicinámicos liberados por las enzimas hidroxicinamoil esterasas. En L.plantarum algunos ácidos hidroxicinámicos (p-cumárico, m-cumárico, o-cumárico, cafeico, ferúlico y sinápico) se reducen a los ácidos florético, 3(3-hidroxi-fenil) propiónico, 3(2-hidroxi-fenil) propiónico, dihidrocafeico, dihidroferúlico, y dihidrosinapico, respectivamente. Estos ácidos reducidos no se degradan posteriormente por L. plantarum (Figura 3).

Análisis transcriptómicos de L. plantarum expuesto a la presencia de ácido p-cumárico permitieron identificar los genes lp_1424 (hcrA) y lp_1425 (hcrB) que codifican una flavin mononucleótido (FMN) reductasa dependiente de NADPH (20). Las proteínas HcrA y HcrB se hiperprodujeron de forma heteróloga y se ensayaron frente a diferentes ácidos hidroxicinámicos (Tabla 1). Estudios genéticos y bioquímicos han permitido concluir que Lp_1425 (HcrB) es la proteína responsable de la actividad hidroxicinamato reductasa, aunque Lp_1424 (HcrA) también es necesaria para la formación de una enzima heterodimérica implicada en la reducción del doble enlace carbono-carbono presente en los ácidos hidroxicinámicos (20).

La presencia del gen hcrB se ha relacionado con la actividad reductasa frente al ácido m-cumárico en las especies del grupo L. plantarum, así como en Enterococcus casseliflavus, Enterococcus gallinarum y Streptococcus gallolyticus (20). Aunque cepas de Companilactobacillus alimentarius, Lapidilactobacillus dextrinicus u otras especies de Enterococcus presentan genes similares a hcr, actualmente no se ha confirmado su actividad hidroxicinamato reductasa.

4.3. Hidroxicinamato descarboxilasa

Además de la reducción directa de los ácidos hidroxicinámicos, las cepas de L. plantarum poseen otra ruta más eficaz para la transformación de estos ácidos. Esta ruta implica dos etapas consecutivas catalizadas por las enzimas hidroxicinamato descarboxilasa y vinilfenol reductasa. En primer lugar, la enzima PAD (Lp_3665) descarboxila los ácidos hidroxicinámicos a vinilfenoles, los cuales se reducen posteriormente por la acción de una vinilfenol reductasa (VprA) a los correspondientes etilfenoles (Figura 3).

De entre los ácidos hidroxicinámicos ensayados, la enzima PAD sólo es capaz de descarboxilar los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico (Tabla 1) (21), lo que implica que la descarboxilasa PAD sólo descarboxila ácidos hidroxicinámicos que poseen un grupo p-hidroxilo con respecto a la cadena lateral insaturada y con sustitución de –H, –OH o –OCH3 en la posición meta. La descarboxilación de los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico origina la formación de etilfenol, etilcatecol y etilguaiacol, respectivamente. Estudios cinéticos realizados en PAD han revelado que, a altas concentraciones de sustrato, tanto el ácido p-cumárico como el ácido cafeico se descarboxilan más eficientemente que el ácido ferúlico (21). Además de en las especies del grupo L. plantarum, se han identificado enzimas similares a la hidroxicinamato descarboxilasa PAD en otras bacterias lácticas de las especies furfurilactobacillus rossiae, Levilactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus y Secundilactobacillus paracollinoides, entre otras.

4.4. Vinilfenol reductasa

La etapa siguiente a la descarboxilación de los ácidos hidroxicinámicos implica la posterior reducción de los vinilfenoles producidos a los correspondientes etilfenoles (Figura 3). Mediante un estudio transcriptómico y el análisis de mutantes knockout de L. plantarum se ha identificado a la enzima Lp_3125 de L. plantarum WCFS1 como la vinilfenol reductasa (VprA) implicada en la reducción de vinilfenoles (22). La proteína VprA (Lp_3125) recombinante redujo todos los vinilfenoles (vinilfenol, vinilcatecol y vinilguaiacol), producidos por la acción de la descarboxilasa PAD sobre los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico (Tabla 1). Este resultado confirma la acción coordinada de estas dos actividades enzimáticas en la transformación de ácidos hidroxicinámicos con la consecuente producción de fenoles volátiles en L. plantarum. Estudios de expresión génica confirmaron esta acción concomitante, ya que la expresión de vprA se indujo por su sustrato (4-vinilfenol), así como por el sustrato de la enzima descarboxilasa PAD (ácido p-cumárico) (22).

A pesar de que las enzimas descarboxilasa PAD y reductasa VprA actúan de forma secuencial y coordinada, a excepción de las especies del grupo L. plantarum, la capacidad de descarboxilar ácidos hidroxicinámicos y reducirlos a etilfenoles no es frecuente en el resto de especies de bacterias lácticas (22, 23). Análisis informáticos indican la presencia de proteínas similares a PAD y VprA de L. plantarum WCFS1 en un reducido número de genomas de bacterias lácticas. Hasta ahora, aparte de las especies del grupo L. plantarum que son capaces de transformar los ácidos hidroxicinámicos en etilfenoles, sólo unas pocas especies pueden reducir los vinilfenoles a etilfenoles (Secundilactobacillus collinoides, S. paracollinoides o F. rossiae) (22).

5. CONCLUSIONES

Esta revisión dilucida el potencial metabólico de L. plantarum para los principales sustratos fenólicos. La aplicación global del metabolismo fenólico de esta especie mediante la fermentación de alimentos vegetales como leguminosas, semillas, verduras, frutas, etc. confirman los resultados de esta revisión y el papel de L. plantarum en la hidrólisis de compuestos fenólicos complejos a moléculas más simples y activas biológicamente (24).

Las rutas de transformación de compuestos fenólicos descritas en este trabajo representan la estrategia metabólica que utilizan las especies del grupo L. plantarum para tolerar la presencia de compuestos fenólicos. Esta adaptación a compuestos fenólicos concede al grupo L. plantarum un papel decisivo en el desarrollo de una comunidad bacteriana durante la fermentación de sustratos vegetales. En este sentido, la transformación de compuestos fenólicos por L. plantarum puede ser útil para proporcionar sustratos menos tóxicos a otras especies bacterianas incapaces de transformar los compuestos fenólicos presentes.

Por otro lado, la presencia de L. plantarum en la fermentación de alimentos vegetales puede aumentar las propiedades saludables de los mismos, puesto que algunos de los compuestos producidos por esta transformación bacteriana de los polifenoles presentes en la dieta pueden presentar propiedades bioactivas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por los proyectos AGL2005-00470, AGL2008-01052, AGL2011-22745, AGL2014-52911-R y AGL2017-84614-C2-2-R financiadas por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por ERDF A way of making Europe. Ana Sánchez Arroyo es beneficiaria del contrato FPI PRE2018-083862 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por ESF Investing in your future.

Recientemente se ha publicado una versión ampliada de este trabajo en International Journal of Food Microbiology (Muñoz y cols., 2024, 412:110555; DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2023.110555).

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Figura 1: Estructuras generales de los ácidos fenólicos.

Figura 2: Rutas bioquímicas para la degradación de compuestos derivados del ácido hidroxibenzoico en Lactiplantibacillus plantarum.

Figura 3: Rutas bioquímicas para la degradación de compuestos derivados del ácido hidroxicinámico en Lactiplantibacillus plantarum.