^{Beatriz Miralles. Científica Titular. Teléfono 910017932. Isidra Recio. Profesora de investigación. Teléfono 910017940
Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL, CSIC-UAM)
C/ Nicolás Cabrera 9. CP.28049 Madrid, España}

INTRODUCCIÓN

La espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta esencial para el análisis de proteínas y péptidos lácteos, por su elevada sensibilidad, velocidad y pequeño tamaño de muestra necesario. Hasta los años 80, no se podían analizar proteínas y péptidos mediante esta técnica debido a su naturaleza no volátil. El desarrollo de técnicas de ionización suaves, electrospray y MALDI, permitió la ionización de moléculas grandes sin fragmentación, con una determinación precisa de masa, una sensibilidad de picomoles y una amplia aplicabilidad¹.

La espectrometría de masas en tándem acoplada a cromatografía de líquidos (LC-MS/MS) es actualmente la técnica de elección para la secuenciación de proteínas y péptidos en productos lácteos. La gestión de la gran cantidad de datos espectrométricos y la estadística aplicada a la interpretación son los principales desafíos en el uso actual de estas herramientas analíticas. Se han desarrollado aplicaciones bioinformáticas para la representación de perfiles, mientras que hay otras destinadas a la discriminación y agrupación. Además, un número cada vez mayor de secuencias de péptidos derivados de proteínas lácteas están siendo alojadas en repositorios públicos. Para la confirmación de la actividad biológica de las secuencias identificadas, también se han desarrollado bases de datos generales de bioactividad como BIOPEP (http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep), que incluye más de 4.000 secuencias, incluyendo péptidos bioactivos, epítopos y elementos sensoriales.

Algunas bases de datos son específicas de bioactividad, como la denominada AntiBP2 de péptidos antimicrobianos², o AHTpin de péptidos antihipertensivos³ o bases de datos de epítopos reconocidos por el sistema inmunitario como IEDB (https://www.iedb.org/home_v3.php)⁴. Otras son exclusivas de péptidos derivados de proteínas lácteas, por ejemplo MBPDB (https://mbpdb.nws.oregonstate. edu/)⁵.

PROTEOMA LÁCTEO Y POLIMORFISMO GENÉTICO

Se conocen cerca de 400 proteínas en la leche, las cuales están presentes en un amplio intervalo de concentraciones y pueden agruparse en tres clases: (i) Proteínas de las micelas de caseína (80-85%), que son estructuras supramoleculares estabilizadas mediante fosfato cálcico coloidal, (ii) Proteínas de suero (13-18%) que se mantienen en disolución en la fase acuosa y (iii) proteínas asociadas a la membrana del glóbulo graso (1-2%), una bicapa de fosfolípidos que engloba proteínas y protege a los glóbulos de grasa de la coalescencia y la lipolisis. La determinación de la composición y la cuantificación de los péptidos y proteínas de las distintas fracciones lácteas permite conocer su papel tanto nutricional como tecnológico⁶.

Recientemente, se han descrito métodos para la cuantificación simultánea de un gran número de proteínas lácteas en un único análisis, lo que facilita la comparación del perfil proteico de distintas muestras de leche⁷.

El empleo de estrategias proteómicas ha permitido tanto ampliar la caracterización de variantes genéticas de proteínas lácteas como su análisis cuantitativo.

Así, se han podido identificar hasta nueve formas bovinas de αs1-caseína, cuatro de αs2-caseína, doce de β-CN, catorce de κ-caseína, tres de α-lactoalbúmina y once de β-lactoglobulina⁸. Por ejemplo, mediante un estudio peptidómico completo de leches individuales se determinaron cinco fenotipos de β-CN: A1A1, A1A2, A1I, A2A2 and A2I en porcentaje 0.035, 0.400, 0.059, 0.482 and 0.024, respectivamente⁹. Existe una demanda creciente de leche con que contenga exclusivamente la variante A2 de la β-caseína por su mejor tolerabilidad y beneficios gastrointestinales.

Mediante un método recientemente validado para la cuantificación de β-caseína en fórmulas infantiles se ha podido detectar β-caseína A1 en fórmulas infantiles A2 con un límite de detección del 2%¹⁰. Por otro lado, uno de los factores más importantes que afectan a la coagulación de la leche es la presencia de determinadas variantes genéticas de las proteínas lácteas mayoritarias, pero además las modificaciones postraduccionales, tales como fosforilación y glicosilación, pueden tener un papel crucial. La comparación de los contenidos de glicomacropéptido de varios rebaños mostró que la variante A con una o dos fosforilaciones daba lugar a una mayor producción de leche, seguida de la variante B fosforilada, teniendo todas las isoformas glicosiladas menor rendimiento en comparación con las no glicosiladas¹¹.

Es importante conocer las regiones de las proteínas resistentes a la digestión gastrointestinal porque ello permitirá vincular secuencias específicas con los efectos sobre la salud. En los últimos años ha habido un gran avance en el estudio de los productos de digestión de las proteínas lácteas mediante análisis del contenido digestivo con espectrometría de masas, tanto en humanos^12,13 como en modelos porcinos^14,15, lo que ha permitido además validar las simulaciones de la digestión in vitro. De hecho, estos estudios se pueden considerar una disciplina denominada digestómica.

La huella peptídica se puede emplear para discriminar productos lácteos de acuerdo con el origen de la leche empleada o las condiciones de elaboración, incluso tras la digestión. En la Figura 1, se muestra un dendrograma obtenido con los péptidos identificados tras la digestión gastrointestinal simulada de yogures empleando la herramienta informática Permut Matrix¹⁶. Teniendo en cuenta tanto la secuencia como la intensidad de los péptidos identificados, se ha podido diferenciar entre yogures elaborados con leche de distinto origen (A y B). Por otro lado, el profundo conocimiento alcanzado del proteoma de la leche hace posible el análisis cuantitativo de proteínas de baja abundancia. Así, el análisis paralelo de ganado Jersey y Kashmiri permitió encontrar en este último la sobreexpresión de algunas proteínas, tales como la monooxigenasa 3 (FMO3), cuya presencia se asocia positivamente con la calidad sensorial de la leche, y aporta un mecanismo de defensa adicional en el caso de ser utilizada para elaborar fórmulas infantiles¹⁷.

CALIDAD DE LA LECHE Y MODIFICACIONES DE LAS PROTEÍNAS CON EL PROCESADO

Las proteínas lácteas pueden sufrir modificaciones de manera natural o bien por el procesado y el almacenamiento. Así, la fosforilación, glicosilación, deamidación, o lactosilación pueden detectarse mediante herramientas proteómicas y han ayudado a explicar los cambios ocurridos por el calentamiento de la leche UHT, o la funcionalidad de las proteínas con estructuras modificadas. Recientemente, se han empleado estas técnicas para evaluar el efecto del tratamiento térmico de las proteínas de suero en su digestibilidad y alergenicidad. Por un lado, la caracterización mediante MALDI-TOF permitió evaluar el grado de lactosilación. Por otro, se pudo asociar el perfil peptídico obtenido mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem, LC-MS/MS, con el grado de hidrólisis durante la digestión y la mayor liberación de epítopos capaces de interaccionar con IgE humana en el producto calentado. También se empleó la espectrometría de masas en la determinación de la bioaccesibilidad de las formas lactosiladas en un modelo celular del epitelio intestinal¹⁸.

Un problema en continuo estudio en el sector lácteo es la identificación precoz de mastitis en el ganado. En 2013 se propuso una estrategia que mediante electroforesis capilar y espectrometría de masas que fue capaz de identificar 154 péptidos biomarcadores de infección, de los cuales 47 podrían discriminar la causa de infección entre S. aureus y E. coli con una sensibilidad del 75% y una especificidad del 100%¹⁹. Más recientemente, se ha utilizado marcaje proteómico y bioinformática para utilizar la saliva de los animales para la identificación de mastitis. En saliva, 63 proteínas de las 2000 identificadas presentaban cambios en su expresión en los casos de infección, y se ha validado el análisis de la proteína gamma- glutamiltransferasa como biomarcador²⁰.

APLICACIONES EN INDUSTRIA QUESERA

El queso representa un complejo ecosistema de bacterias, procedentes o no del cultivo iniciador, cuya actividad proteolítica se modifica a lo largo de la maduración. Con los avances en las determinaciones analíticas y las tecnologías ómicas, se han podido mapear miles de componentes individuales del queso, incluyendo las poblaciones microbianas, los productos de proteólisis, y un enorme número de metabolitos procedentes de la fermentación²¹. En algunos casos, para discriminar quesos de diferente calidad elaborados por la misma compañía, se emplean como biomarcadores aminoácidos, acidos orgánicos y otros metabolitos²². Pero las propias secuencias peptídicas podrían emplearse para discriminar la cepa empleada como fermento si se emplean herramientas capaces de asociar el perfil peptídico con la especificidad enzimática²³.

En quesos, existe controversia sobre si el envasado puede tener efecto en el proceso de maduración. Se ha comparado el perfil peptídico de quesos semiduros elaborados con mezcla de leche pasteurizada de oveja, vaca y cabra envasados mediante envasado al vacío y atmósfera modificada. A tiempos largos de almacenamiento se encontró mayor proporción en algunas secuencias derivadas de la αs1-caseína en el queso envasado al vacío (Figura 2)²⁴.

El queso, como producto fermentado, contiene cientos de oligopéptidos y polipéptidos, que contribuyen a las características organolépticas del mismo. Se han desarrollado métodos que permiten identificar fragmentos de caseínas resultantes de la digestión in silico inespecífica de caseínas. Los péptidos candidatos se enfrentan a fracciones con sabor amargo separadas mediante cromatografía para localizar las secuencias responsables del sabor. La combinación de estos datos con el análisis sensorial se ha denominado sensoproteómica²⁵. La Tabla 1 muestra algunos ejemplos de la aplicación de la proteómica y peptidómica en la industria quesera.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Además de las técnicas tradicionales para analizar proteínas y péptidos lácteos, como la cromatografía y la electroforesis, se están utilizando nuevas técnicas de separación con columnas de microrrellenos y microchips que permiten la aplicación de herramientas proteómicas. Los avances en espectrometría de masas de alta resolución, así como los softwares de análisis y su adaptación a la tecnología de alimentos van a permitir tanto la identificación de un elevado número de componentes en mezclas complejas como de proteínas intactas. Además, se pueden esperar importantes hallazgos que permitirán expandir nuestro conocimiento acerca de los alérgenos, la funcionalidad de los péptidos o la composición del digestoma.

También las simulaciones a partir de herramientas bioinformáticas son herramientas emergentes que permitirán predecir actividades biológicas o tecnológicas en los productos lácteos y explicar los mecanismos subyacentes.

Figura 1. Clasificación por intensidad de los péptidos derivados de αs1-, αs2-, β- yκ-caseína identificados tras la digestión gastrointestinal simulada (n=3) de yogures utilizando la herramienta informática Permut Matrix. Los yogures habían sido elaborados a partir de leche de origen A y B.

Tabla 1. Aplicaciones de proteómica y peptidómica en la industria quesera

Figura 2. Péptidos derivados de αs1-caseína identificados en el extracto soluble acuoso de quesos semiduros envasados al vacío (VP) y en atmosfera modificada (MAP), a tiempos de almacenamiento en días: 0 (1), 30 (2), 60 (3), 90 (4) y 150 (5), representándose la intensidad de estos últimos a tiempo 0. Los fragmentos son de origen bovino (c), ovino (s) y caprino (g). Tomado de Sánchez-Rivera et al. 2013. J. Dairy Sci. 96: 3551-3557.